La tri gajnintoj de la 2019-datita Nobel-premio pri Fiziologio aŭ Medicino, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza kaj Sir Peter J. Ratcliffe jam gajnis la 2016-datita Premion Lasker pri Baza Medicino pro sia laboro pri kiel ĉeloj sentas kaj adaptiĝas. al hipoksio, do ĝi ne estis aparte surpriza. Ili malkovris kaj identigis la ŝlosilan molekulon hipoksi-induktebla faktoro 1 (HIF-1). Hodiaŭ ni volas reiri al la origino de la studo, kiu estas eritropoetino, aŭ EPO, mirakla molekulo.

Ĝi estas la plej grava faktoro en produktado de ruĝaj globuloj

Ruĝaj globuloj estas la plej abunda tipo de sangoĉeloj en la sango, kaj estas la ĉefa medio por transporti oksigenon kaj karbondioksidon tra la sango de vertebruloj. Eritrocitoj estas generitaj en la osta medolo: Hematopoezaj stamĉeloj unue multiĝas kaj diferenciĝas en prapatrojn de diversaj sangoĉeloj, kaj eritroidaj prapatroj povas plue diferenciĝi kaj maturiĝi en eritrocitojn. En normalaj kondiĉoj, homa produktokvanto de eritrocito estas tre malalta, sed sub streso kiel ekzemple sangado, hemolizo kaj hipoksio, la indico de eritrocita produktado povas esti pliigita ĝis ok fojojn. En ĉi tiu procezo, eritropoetina EPO estas unu el la plej gravaj faktoroj.

EPO estas hormono sintezita ĉefe en la reno. Ĝia kemia naturo estas tre glikozilata proteino. Kial en la renoj? Ĉirkaŭ litro da sango fluas tra la renoj ĉiuminute, do ili povas rapide kaj efike detekti ŝanĝojn en la oksigenniveloj en la sango. Kiam oksigenniveloj en la sango estas malaltaj, la renoj respondas rapide kaj produktas grandajn kvantojn de EPO. Ĉi-lasta cirkulas tra la sangocirkulado al la osta medolo, kie ĝi antaŭenigas la konvertiĝon de eritroidaj praĉeloj en ruĝajn globulojn. Maturaj ruĝaj globuloj estas liberigitaj de la osta medolo en la cirkulan sistemon por plibonigi la kapablon de la korpo ligi al oksigeno. Kiam la renoj sentas pliiĝon de oksigeno en la sango, ili reduktas EPO-produktadon, kiu siavice reduktas la kvanton de ruĝaj globuloj en la osta medolo.

Ĉi tio faras perfektan alĝustigbuklon. Tamen, homoj vivantaj en alta altitudo kaj iuj anemiaj pacientoj ofte renkontas la kondiĉon de kontinue malalta sango-oksigena nivelo, kiu ne povas kompletigi la supran cirkuladon kaj stimuli la renon senĉese sekreci EPO, tiel ke la sanga EPO-koncentriĝo estas pli alta ol ordinaraj homoj.

Necesis preskaŭ 80 jaroj por malkovri ĝin

Kiel multaj gravaj eltrovaĵoj, la kompreno de sciencistoj pri EPO ne estis glata velado, kun demandoj kaj defioj survoje. Daŭris preskaŭ 80 jarojn de la koncepto de EPO ĝis la fina persistemo de la specifa molekulo.

En 1906, francaj sciencistoj Carnot kaj Deflandre injektis normalajn kuniklojn per la serumo de anemiaj kunikloj kaj trovis ke la kalkulo de ruĝaj globuloj en la plasmo de normalaj kunikloj pliiĝis. Ili kredis, ke iuj humoraj faktoroj en la plasmo povus stimuli kaj reguligi la produktadon de ruĝaj globuloj. Tio estis la unua EPO-konceptprototipo. Bedaŭrinde, la rezultoj ne estis reproduktitaj en postaj jardekoj, ĉefe ĉar la kalkulo de novaj ruĝaj globuloj ne estis preciza.

La parabiozo-eksperimento de Reissmann kaj Ruhenstroth-Bauer en 1950 disponigis vere fortan indicon. Ili kirurgie ligis la cirkuladsistemojn de du vivantaj ratoj, metante unu en hipoksan medion kaj la alian spirante normalan aeron. Kiel rezulto, ambaŭ musoj produktis masivajn kvantojn de ruĝaj globuloj. Ne estas dubo, ke estas hormono en la sangocirkulado, kiu stimulas la produktadon de ruĝaj globuloj, de kiuj EPO ricevas sian nomon. Aliflanke, EPO estas tre sentema al hipoksio.

Kio molekulo estas EPO? La usona sciencisto Goldwasser bezonis 30 jarojn por finfine klarigi la problemon je la biokemia nivelo. Se laboristo volas fari bonan laboron, li unue devas akrigi siajn ilojn. La funkcio de EPO estas stimuli novajn ruĝajn globulojn, sedla kalkulo de ĉi-lasta ne estas preciza. La plej grava funkcia molekulo en ruĝaj globuloj estas hemo enhavanta hemoglobinon, kiu enhavas feran jonon en sia centro. Do la teamo de Goldwasser etikedis novnaskitajn eritrocitojn kun radioaktivaj ferizotopoj kaj evoluigis senteman metodon por detekti EPO-agadon. Ĉi tio ebligas izoli kaj purigi tre malaltajn koncentriĝojn de EPO (nanogramoj per mililitro) de bestaj fluidaj specimenoj. Sed la izoliteco de EPO estis ege malfacila. Ili ŝanĝis de reno al anemia ŝafa plasmo, al la urino de pacientoj kun severa fermanko pro ankilostera infekto, kaj finfine, en 1977, purigis 8 miligramojn da homa EPO-proteino el 2 550 litroj da urino de japanaj pacientoj kun aplasta anemio.

En 1985, la proteinsekvencado kaj genklonado de homa EPO estis kompletigitaj. La EPO-geno ĉifras polipeptidon kun 193 aminorestaĵoj, kiu iĝas matura proteino kunmetita de 166 aminoacidrestaĵoj post kiam la signalpeptido estas tondita dum sekrecio, kaj enhavas 4 ejojn por glikosilatmodifo. En 1998, la NMR solvstrukturo de EPO kaj la kristalstrukturo de EPO kaj ĝia receptorkomplekso estis analizitaj. Je ĉi tiu punkto, homoj havas la plej intuician komprenon pri EPO.

Ĝis nun, kuracado de anemio kutime postulis sangotransfuzoj por replenigi la mankon de ruĝaj globuloj. Ĉar homoj lernas pli pri EPO, injekti ĝin por stimuli la produktadon de ruĝaj globuloj en sia propra osta medolo faciligis la problemon. Sed purigi EPO rekte de korpaj fluidoj, kiel Goldwasser faris, estas malfacila kaj rendimentoj estas malaltaj. La persistemo de EPO-proteino kaj gensekvenco ebligis produkti rekombinan homan EPO en grandaj kvantoj.

Ĝi estis farita de bioteknologia firmao nomita Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen estis fondita en 1980 kun nur sep membroj, esperante fari biofarmaciaĵojn kun la tiam emerĝantaj teknikoj de molekula biologio. Interferono, kreskhormono liberiganta faktoro, hepatito B-vakcino, epiderma kreskfaktoro estis inter la varmaj nomoj en ilia listo de celoj, sed neniu el tiuj provoj sukcesis. Ĝis 1985, Lin Fukun, ĉina sciencisto el Tajvano, Ĉinio, klonis la genon de homa EPO, kaj tiam realigis la produktadon de sinteza EPO uzante DNA-rekombinigteknologion.

Rekombina homa EPO havas la saman sekvencon kiel endogena EPO-proteino, kaj ankaŭ havas similan glikosilatmodifon. Nature, rekombina homa EPO ankaŭ havas la agadon de endogena EPO. En junio 1989, la unua produkto de Amgen, rekombina homa eritropoetina Epogen, estis aprobita fare de la usona FDA por la terapio de anemio kaŭzita de kronika rena malfunkcio kaj anemio en la terapio de HIV-infekto. Epogen-vendo superis 16 milionojn USD en nur tri monatoj. Dum la venontaj du jardekoj, Amgen dominis la merkaton por rekunmetita homa EPO. Epogen alportis al Amgen 2.5 miliardojn USD en enspezo en 2010 sole. En 2018, la borsvaloro de Amgen estis 128.8 miliardoj USD, igante ĝin la oka plej granda farmacia kompanio en la mondo.

Notindas, ke Amgen komence laboris kun Goldwasser por disponigi purigitajn homajn EPO-proteinojn por sekvencado, sed Goldwasser kaj Amgen baldaŭ elfalis pro ideologiaj diferencoj. Goldwasser kaj lia Universitato de Ĉikago, kiu faris bazajn esplorojn, neniam pensis patenti la hormonon, kiun li malkovris, kaj do ne ricevis eĉ unu pencon por la grandega komerca sukceso de EPO.

Ĝi -- kiel ĝi estas stimulilo

Kiam ni spiras, oksigeno eniras la mitokondriojn de la ĉeloj por movi la spiran ĉenon kaj produkti amasajn kvantojn de ATP, la ĉefa fonto de energio en niaj korpoj. Anemiaj homoj ne havas sufiĉe da sanaj ruĝaj globuloj, kaj la plej tuja efiko estas, ke ili ne prenas sufiĉe da oksigeno, kio igas ilin sentiĝi lacaj, simile al spirproblemoj dum longa daŭro. Se injektite kun rekombina homa EPO, la korpoj de pacientoj de anemio produktas pli da eritrocitoj,portas pli da oksigeno, kaj produktas pli da la energia molekulo ATP, efike malpezigante simptomojn.

Tamen, iuj sportaj laboristoj ankaŭ komencis pensi pri rekombina homa EPO. Se la artefarita rekombina hormono de EPO-tipo estas uzata por stimuli la korpon de la atletoj produkti pli da ruĝaj globuloj, eblas plibonigi la kapablon de la atletoj akiri oksigenon kaj produkti energiajn molekulojn, kio ankaŭ povas plibonigi la agadon de atletoj en pacienco. okazaĵoj kiel ekzemple biciklado, longdistanca kurado kaj skikurado. Artikolo de 1980 en la Journal of Applied Physiology montris, ke sangaj stimuliloj (eritropoetino, artefaritaj oksigenportiloj kaj sangotransfuzoj) povas pliigi eltenemon je 34 procentoj. Se atletoj uzas la EPO, ili povas kuri 8 kilometrojn sur la tretmuelejo en 44 sekundoj malpli da tempo ol antaŭe. Fakte, biciklado kaj maratonoj estis la plej malbonaj krimuloj por EPO-stimuliloj. Dum la 1998-datita Tour de France, hispana teamkuracisto por la Festina teamo estis arestita ĉe la franca limo kun 400 boteloj da artefarita rekombina EPO! La rezulto, kompreneble, estis ke la tuta teamo estis elĵetita el la Turneo kaj malpermesita.

La Internacia Olimpika Komitato aldonis EPO al sia malpermesita listo ĉe la Barcelona Ludoj en 1992, sed reorganizi homan EPO-testadon estis tiel malfacila ke antaŭ la Ludoj de 2000 ne estis maniero efike detekti ĉu atletoj uzis ĝin. Estas pluraj kialoj: 1) enhavo de EPO en korpaj fluidoj estas tre malalta, kaj EPO per ml da sango en normalaj homoj estas ĉirkaŭ 130-230 nanogramoj; 2) La aminoacida komponado de artefarita rekombina EPO estas ĝuste la sama kiel tiu de homa endogena EPO-proteino, nur la formo de glikosilado estas tre iomete malsama; 3) La duoniĝotempo de EPO en la sango estas nur 5-6 horoj, kaj ĝi estas ĝenerale nerimarkebla 4-7 tagojn post la lasta injekto; 4) La individua EPO-nivelo estas tre malsama, do malfacilas establi absolutan kvantan normon.

Ekde 2000, WADA utiligis urintestadon kiel la nuran sciencan konfirmmetodon por rekta detekto de rekombina EPO. Pro la etaj diferencoj inter la glikoiligita formo de la artefarita rekombina EPO kaj tiu de la homa EPO, la ŝarĝitaj trajtoj de la du molekuloj estas tre malgrandaj kaj povas esti distingitaj per elektroforezmetodo nomita izoelektra fokuso, kiu estas la ĉefa strategio por la rekta detekto de la artefarita rekombina EPO. Tamen, iu rekombina EPO esprimita de homaj derivitaj ĉeloj montris neniun diferencon en glikosiligo, do kelkaj fakuloj sugestis ke eksogena EPO kaj endogena EPO devus esti distingitaj per malsama karbona izotopa enhavo.

Fakte, ekzistas ankoraŭ limigoj en malsamaj testaj metodoj por EPO. Ekzemple, Lance Armstrong, la amerika biciklada legendo, konfesis preni EPO kaj aliajn stimulilojn dum siaj sep venkoj en Tour de France, sed li ne estis fakte konfirmita pozitiva por EPO en iu dopa testo en tiu tempo. Ni ankoraŭ devas atendi kaj vidi ĉu ĝi estas "unu piedo pli alta" aŭ "unu piedo pli alta".

Kiel ĝi faras Nobel-premion

Fina vorto pri la ligo inter EPO kaj la 2019-datita Nobel-premio pri Fiziologio aŭ Medicino.

EPO estas la plej tipa kazo de la percepto kaj respondo de homa korpo al hipoksio. Tial, Semenza kaj Ratcliffe, du Nobel-premiitoj, elektis EPO kiel la deirpunkton por studi la mekanismon de ĉelpercepto kaj adaptado al hipoksio. La unua paŝo estis trovi la elementojn de EPO-geno kiu povis respondi al oksigenŝanĝoj. Semenza identigis ŝlosilan 256-bazan ne-kodan sekvencon ĉe la 3' laŭflua fino de la geno kodanta EPO, nomita la hipoksia respondelemento. Se tiu elementsekvenco estas mutaciita aŭ forigita, la kapablo de la EPO-proteino respondi al hipoksio estas tre reduktita. Se tiu elementsekvenco estas kunfandita al la kontraŭflua 3' fino de aliaj genoj ne asociitaj kun hipoksio, tiuj modifitaj genoj ankaŭ montras EPO-similan aktivigon.sub hipoksiaj kondiĉoj.

Ratcliffe kaj lia teamo tiam malkovris ke tiu hipoksa respondelemento ne nur ĉeestas en la renaj aŭ hepataj ĉeloj respondecaj por la produktado de EPO, sed ankaŭ en multaj aliaj ĉeltipoj kiuj povas funkcii sub hipoksaj kondiĉoj. Alivorte, tiu respondo al hipoksio eble ne estas specifa por EPO, sed prefere pli ĝeneraligita fenomeno en ĉeloj. Tiuj aliaj ĉeloj, kiuj ne respondecas pri EPO-produktado, devas enhavi molekulojn (kiel ekzemple transkripcifaktoroj respondecaj por ŝaltado de genekspresio) kiuj sentas ŝanĝojn en oksigenkoncentriĝo kaj ligas al hipoksaj respondelementoj por ŝalti genojn kiel ekzemple EPO.