फिजियोलोजी वा मेडिसिनमा 2019 नोबेल पुरस्कारका तीन विजेताहरू, विलियम जी केलिन, जूनियर, ग्रेग एल. सेमेन्जा र सर पिटर जे. रैटक्लिफले कोशिकाहरूले कसरी बुझ्ने र अनुकूलन गर्ने भन्नेमा उनीहरूको कामको लागि आधारभूत चिकित्सामा 2016 लास्कर पुरस्कार जितिसकेका छन्। हाइपोक्सिया, त्यसैले यो विशेष गरी आश्चर्यजनक थिएन। तिनीहरूले प्रमुख अणु हाइपोक्सिया-इन्ड्युसिबल कारक 1 (HIF-1) पत्ता लगाए र पहिचान गरे। आज हामी अध्ययनको उत्पत्तिमा फर्कन चाहन्छौं, जुन erythropoietin, वा EPO, एक चमत्कारी अणु हो।

यो रातो रक्त कोशिका उत्पादन मा सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कारक हो

रातो रक्त कोशिकाहरू रगतमा सबैभन्दा प्रचुर मात्रामा रक्त कोशिकाहरू हुन्, र कशेरुकाहरूको रगत मार्फत अक्सिजन र कार्बन डाइअक्साइड ढुवानी गर्ने मुख्य माध्यम हुन्। एरिथ्रोसाइटहरू हड्डी मज्जामा उत्पन्न हुन्छन्: हेमाटोपोएटिक स्टेम सेलहरू पहिले बढ्छन् र विभिन्न रक्त कोशिकाहरूको पूर्वजहरूमा भिन्न हुन्छन्, र एरिथ्रोइड प्रोजेनिटरहरूले थप भिन्नता र एरिथ्रोसाइटहरूमा परिपक्व हुन सक्छन्। सामान्य अवस्थामा, मानव एरिथ्रोसाइट उत्पादन दर धेरै कम हुन्छ, तर रक्तस्राव, हेमोलाइसिस र हाइपोक्सिया जस्ता तनावमा, एरिथ्रोसाइट उत्पादन दर आठ गुणा सम्म बढ्न सक्छ। यस प्रक्रियामा, erythropoietin EPO सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कारकहरू मध्ये एक हो।

EPO मुख्यतया मृगौलामा संश्लेषित हार्मोन हो। यसको रासायनिक प्रकृति एक उच्च ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन हो। मृगौलामा किन हुन्छ ? मिर्गौलाबाट हरेक मिनेट लगभग एक लिटर रगत बग्छ, त्यसैले तिनीहरूले रगतमा अक्सिजनको स्तरमा भएका परिवर्तनहरू छिटो र प्रभावकारी रूपमा पत्ता लगाउन सक्छन्। जब रगतमा अक्सिजनको मात्रा कम हुन्छ, मृगौलाले छिटो प्रतिक्रिया दिन्छ र ठूलो मात्रामा EPO उत्पादन गर्छ। पछिल्लो रक्तप्रवाह मार्फत हड्डी मज्जामा फैलिन्छ, जहाँ यसले एरिथ्रोइड प्रोजेनिटर कोशिकाहरूलाई रातो रक्त कोशिकाहरूमा रूपान्तरण गर्दछ। परिपक्व रातो रक्त कोशिकाहरू हड्डी मज्जाबाट रक्तसंचार प्रणालीमा छोडिन्छन् जसले शरीरको अक्सिजनमा बाँध्ने क्षमतालाई सुधार गर्दछ। जब मृगौलाले रगतमा अक्सिजन बढेको महसुस गर्छ, तिनीहरूले EPO उत्पादन घटाउँछन्, जसले फलस्वरूप हड्डीको मज्जामा रातो रक्त कोशिकाहरूको मात्रा घटाउँछ।

यसले एक उत्तम समायोजन लूप बनाउँछ। तथापि, उच्च उचाइमा बस्ने मानिसहरू र केही एनिमिया रोगीहरूले अक्सर लगातार कम रगत अक्सिजन स्तरको अवस्था सामना गर्छन्, जसले माथिको परिसंचरण पूरा गर्न सक्दैन र मृगौलालाई लगातार EPO स्राव गर्न उत्प्रेरित गर्दछ, जसले गर्दा रगत EPO एकाग्रता सामान्य मानिसहरूको भन्दा बढी हुन्छ।

यसलाई उजागर गर्न लगभग 80 वर्ष लाग्यो

धेरै ठूला आविष्कारहरू जस्तै, EPO बारे वैज्ञानिकहरूको बुझाइ सहज यात्रा भएको छैन, बाटोमा प्रश्न र चुनौतीहरू छन्। EPO को अवधारणा देखि विशिष्ट अणु को अन्तिम निर्धारण सम्म लगभग 80 वर्ष लाग्यो।

1906 मा, फ्रान्सेली वैज्ञानिकहरू कार्नोट र डेफ्लान्ड्रेले एनिमिक खरगोशको सीरमको साथ सामान्य खरायो सुई लगाए र पत्ता लगाए कि सामान्य खरायोको प्लाज्मामा रातो रक्त कोशिकाको संख्या बढेको छ। तिनीहरूले विश्वास गरे कि प्लाज्मामा केही हास्य कारकहरूले रातो रक्त कोशिकाहरूको उत्पादनलाई उत्तेजित र विनियमित गर्न सक्छ। यो पहिलो EPO अवधारणा प्रोटोटाइप थियो। दुर्भाग्यवश, परिणामहरू पछिल्ला दशकहरूमा दोहोरिएका छैनन्, मुख्यतया किनभने नयाँ रातो रक्त कोशिकाहरूको गणना सही थिएन।

1950 मा Reissmann र Ruhenstroth-Bauer को प्याराबायोसिस प्रयोगले वास्तवमै बलियो प्रमाण प्रदान गर्यो। तिनीहरूले शल्यक्रियाद्वारा दुई जीवित मुसाको रक्तसंचार प्रणालीलाई जोडे, एउटालाई हाइपोक्सिक वातावरणमा राखेर र अर्कोले सामान्य हावामा सास फेर्न। नतिजाको रूपमा, दुबै मुसाहरूले ठूलो मात्रामा रातो रक्त कोशिकाहरू उत्पादन गरे। त्यहाँ कुनै शङ्का छैन कि रक्तप्रवाहमा एक हर्मोन छ जसले रातो रक्त कोशिकाहरूको उत्पादनलाई उत्तेजित गर्छ, जसबाट EPO नाम प्राप्त हुन्छ। अर्कोतर्फ, EPO हाइपोक्सियाको लागि धेरै संवेदनशील छ।

EPO के अणु हो? बायोकेमिकल स्तरमा यो समस्यालाई अन्ततः स्पष्ट गर्न अमेरिकी वैज्ञानिक गोल्डवासरलाई 30 वर्ष लाग्यो। यदि कुनै कामदारले राम्रो काम गर्न चाहन्छ भने, उसले पहिले आफ्नो औजारलाई तिखार्नुपर्छ। EPO को कार्य नयाँ रातो रक्त कोशिकाहरूलाई उत्तेजित गर्नु हो, तरपछिल्लोको गणना सही छैन। रातो रक्त कोशिकाहरूमा सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कार्यात्मक अणु हेमोग्लोबिन समावेश गर्दछ, जसको केन्द्रमा एक लौह आयन हुन्छ। त्यसैले गोल्डवासरको टोलीले नवजात शिशुको रातो रक्त कोशिकाहरूलाई रेडियोएक्टिभ आइरन आइसोटोपको साथ लेबल गर्यो र EPO गतिविधि पत्ता लगाउनको लागि एक संवेदनशील विधि विकास गर्यो। यसले जनावरको तरल पदार्थका नमूनाहरूबाट EPO (नानोग्राम प्रति मिलिलिटर) को धेरै कम सांद्रतालाई अलग गर्न र शुद्ध गर्न सम्भव बनाउँछ। तर EPO को अलगाव अत्यन्तै गाह्रो थियो। तिनीहरूले मृगौलाबाट एनिमिक भेडाको प्लाज्मा, हुकवर्म संक्रमणको कारण गम्भीर फलामको कमी भएका बिरामीहरूको पिसाबमा स्विच गरे र अन्ततः, 1977 मा, एप्लास्टिक एनीमिया भएका जापानी बिरामीहरूको 2,550 लिटर पिसाबबाट 8 मिलिग्राम मानव ईपीओ प्रोटिन शुद्ध गरे।

1985 मा, प्रोटीन अनुक्रम र मानव EPO को जीन क्लोनिंग पूरा भयो। EPO जीनले 193 एमिनो अवशेषहरूको साथ एक पोलिपेप्टाइड इन्कोड गर्दछ, जुन 166 एमिनो एसिड अवशेषहरू मिलेर बनेको परिपक्व प्रोटीन बन्छ जब संकेत पेप्टाइड स्रावको समयमा क्लिप हुन्छ, र ग्लाइकोसिलेशन परिमार्जनको लागि 4 साइटहरू समावेश गर्दछ। 1998 मा, EPO को NMR समाधान संरचना र EPO को क्रिस्टल संरचना र यसको रिसेप्टर कम्प्लेक्स विश्लेषण गरियो। यस बिन्दुमा, मानिसहरूसँग EPO को सबैभन्दा सहज समझ छ।

अहिले सम्म, एनीमिया को उपचार को लागी रातो रक्त कोशिकाहरु को कमी को पूर्ति गर्न को लागी सामान्यतया रगत चढाउनु पर्छ। मानिसहरूले EPO बारे थप जान्न थालेपछि, तिनीहरूको आफ्नै हड्डी मज्जामा रातो रक्त कोशिका उत्पादनलाई उत्तेजित गर्न इन्जेक्सनले समस्यालाई सजिलो बनाएको छ। तर गोल्डवासरले जस्तै शरीरको तरल पदार्थबाट ईपीओलाई शुद्ध गर्न गाह्रो छ र उत्पादन कम छ। ईपीओ प्रोटिन र जीन अनुक्रमको निर्धारणले ठूलो मात्रामा पुन: संयोजक मानव ईपीओ उत्पादन गर्न सम्भव बनायो।

यो एप्लाइड मोलिक्युलर जेनेटिक्स (एमजेन) नामक बायोटेक्नोलोजी कम्पनीले गरेको थियो। एमजेन 1980 मा केवल सात सदस्यहरूसँग स्थापना भएको थियो, आणविक जीवविज्ञानको तत्कालीन उदीयमान प्रविधिहरूसँग बायोफार्मास्युटिकल्स बनाउने आशामा। इन्टरफेरोन, ग्रोथ हार्मोन रिलिजिङ कारक, हेपाटाइटिस बी भ्याक्सिन, एपिडर्मल ग्रोथ फ्याक्टर उनीहरूको लक्ष्यको सूचीमा तातो नामहरू थिए, तर यी मध्ये कुनै पनि प्रयास सफल भएनन्। 1985 सम्म, ताइवान, चीनका चिनियाँ वैज्ञानिक लिन फुकुनले मानव ईपीओको जीन क्लोन गरे र त्यसपछि डीएनए पुनर्संयोजन प्रविधि प्रयोग गरेर सिंथेटिक ईपीओको उत्पादन महसुस गरे।

पुन: संयोजक मानव ईपीओको अन्तर्जात ईपीओ प्रोटीनको समान अनुक्रम छ, र त्यस्तै ग्लाइकोसिलेशन परिमार्जन पनि छ। स्वाभाविक रूपमा, पुनः संयोजक मानव ईपीओमा पनि अन्तर्जात ईपीओको गतिविधि हुन्छ। जून 1989 मा, एमजेनको पहिलो उत्पादन, पुन: संयोजक मानव एरिथ्रोपोइटिन इपोजेन, एचआईभी संक्रमणको उपचारमा पुरानो मृगौला विफलता र एनीमियाको कारण एनीमियाको उपचारको लागि यूएस एफडीए द्वारा अनुमोदन गरिएको थियो। इपोजेनको बिक्री मात्र तीन महिनामा $ 16 मिलियन भन्दा माथि छ। अर्को दुई दशकहरूमा, एम्जेनले पुन: एसेम्बल गरिएको मानव ईपीओको बजारमा प्रभुत्व जमायो। Epogen ले 2010 मा मात्र Amgen $ 2.5 बिलियन राजस्व ल्यायो। 2018 मा, Amgen को शेयर बजार मूल्य $ 128.8 बिलियन थियो, जसले यसलाई विश्वको आठौं ठूलो औषधि कम्पनी बनायो।

यो ध्यान दिन लायक छ कि एमजेनले सुरुमा गोल्डवासरसँग प्युरिफाइड मानव ईपीओ प्रोटिनहरू उपलब्ध गराउनको लागि काम गर्यो, तर गोल्डवासर र एमजेन चाँडै नै वैचारिक भिन्नताका कारण बाहिरिए। गोल्डवासर र उनको शिकागो विश्वविद्यालय, जसले आधारभूत अनुसन्धान गर्‍यो, उसले पत्ता लगाएको हर्मोनलाई पेटेन्ट गर्ने कहिल्यै सोचेको थिएन, र यसैले EPO को ठूलो व्यावसायिक सफलताको लागि एक पैसा पनि प्राप्त गरेको छैन।

यो - यो कसरी एक उत्तेजक छ

जब हामी सास फेर्छौं, अक्सिजन कोशिकाको माइटोकोन्ड्रियामा प्रवेश गर्छ श्वासप्रश्वासको चेन चलाउन र हाम्रो शरीरमा ऊर्जाको मुख्य स्रोत एटीपीको ठूलो मात्रा उत्पादन गर्दछ। रक्तअल्पता भएका मानिसहरूसँग पर्याप्त स्वस्थ रातो रक्त कोशिकाहरू हुँदैनन्, र सबैभन्दा तत्काल प्रभाव भनेको उनीहरूले पर्याप्त अक्सिजन लिन सक्दैनन्, जसले गर्दा उनीहरूलाई थकान महसुस हुन्छ, लामो समयसम्म सास फेर्न समस्या जस्तै। जब पुनः संयोजक मानव ईपीओको साथ सुई लगाइन्छ, एनीमिया रोगीहरूको शरीरले अधिक रातो रक्त कोशिकाहरू उत्पादन गर्दछ,अधिक अक्सिजन बोक्ने, र अधिक ऊर्जा अणु एटीपी उत्पादन गर्छ, प्रभावकारी रूपमा लक्षणहरू कम गर्छ।

यद्यपि, केही खेलकुदकर्मीहरूले पुन: संयोजक मानव ईपीओको बारेमा पनि सोच्न थालेका छन्। यदि ईपीओ प्रकारको कृत्रिम पुनः संयोजक हार्मोन एथलीटहरूको शरीरलाई थप रातो रक्त कोशिकाहरू उत्पादन गर्न उत्तेजित गर्न प्रयोग गरिन्छ भने, यसले एथलीटहरूको अक्सिजन प्राप्त गर्ने र ऊर्जा अणुहरू उत्पादन गर्ने क्षमतामा सुधार गर्न सम्भव छ, जसले एथलीटहरूको सहनशीलतामा प्रदर्शन सुधार गर्न सक्छ। साइकल चलाउने, लामो दूरीको दौड र क्रस-कन्ट्री स्कीइङ जस्ता घटनाहरू। एप्लाइड फिजियोलोजीको जर्नलमा 1980 को एउटा पेपरले देखायो कि रगत उत्तेजक पदार्थ (एरिथ्रोपोइटिन, कृत्रिम अक्सिजन वाहक र रगत ट्रान्सफ्युजन) ले 34 प्रतिशतले सहनशीलता बढाउन सक्छ। यदि एथलीटहरूले EPO प्रयोग गरे भने, उनीहरूले पहिलेको तुलनामा 44 सेकेन्ड कम समयमा ट्रेडमिलमा 8 किलोमिटर दौडन सक्छन्। वास्तवमा, साइकल र म्याराथनहरू EPO उत्तेजकहरूका लागि सबैभन्दा खराब अपराधी भएका छन्। 1998 टुर डे फ्रान्सको समयमा, फेस्टिना टोलीका लागि स्पेनी टोलीका डाक्टरलाई 400 बोतल कृत्रिम पुनः संयोजक EPO सहित फ्रान्सेली सीमामा पक्राउ गरिएको थियो! नतिजा, निस्सन्देह, सम्पूर्ण टोली टुरबाट बाहिर निकालियो र प्रतिबन्धित भयो।

अन्तर्राष्ट्रिय ओलम्पिक समितिले 1992 बार्सिलोना खेलहरूमा यसको प्रतिबन्धित सूचीमा EPO थप्यो, तर मानव EPO परीक्षणलाई पुनर्गठन गर्न यति गाह्रो थियो कि 2000 खेलहरू अघि खेलाडीहरूले यसलाई प्रयोग गर्दै थिए कि भनेर प्रभावकारी रूपमा पत्ता लगाउने कुनै तरिका थिएन। त्यहाँ धेरै कारणहरू छन्: 1) शरीरको तरल पदार्थमा EPO सामग्री धेरै कम छ, र सामान्य व्यक्तिहरूमा EPO प्रति एमएल रगत लगभग 130-230 न्यानोग्राम हुन्छ; 2) कृत्रिम पुनः संयोजक EPO को एमिनो एसिड संरचना मानव अन्तर्जात EPO प्रोटिनको जस्तै हो, केवल ग्लाइकोसिलेशन को रूप एकदम अलि फरक छ; 3) रगतमा EPO को आधा-जीवन मात्र 5-6 घण्टा छ, र यो सामान्यतया अन्तिम इंजेक्शन पछि 4-7 दिन पत्ता लगाउन सकिँदैन; 4) व्यक्तिगत EPO स्तर धेरै फरक छ, त्यसैले यो एक निरपेक्ष मात्रात्मक मानक स्थापना गर्न गाह्रो छ।

2000 देखि, WADA ले पुन: संयोजक EPO को प्रत्यक्ष पत्ता लगाउनको लागि एक मात्र वैज्ञानिक प्रमाणीकरण विधिको रूपमा मूत्र परीक्षण प्रयोग गरेको छ। कृत्रिम पुनः संयोजक EPO र मानव EPO को ग्लाइकोइलेटेड रूप बीचको अलिकति भिन्नताको कारण, दुई अणुहरूको चार्ज गरिएको गुणहरू धेरै साना छन् र आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग भनिने इलेक्ट्रोफोरेसिस विधिद्वारा छुट्याउन सकिन्छ, जुन मुख्य रणनीति हो। कृत्रिम पुनः संयोजक EPO को प्रत्यक्ष पहिचान। यद्यपि, मानव व्युत्पन्न कोशिकाहरूद्वारा व्यक्त गरिएका केही पुन: संयोजक ईपीओले ग्लाइकोसिलेशनमा कुनै भिन्नता देखाएन, त्यसैले केही विशेषज्ञहरूले सुझाव दिए कि एक्सोजेनस ईपीओ र एन्डोजेनस ईपीओ फरक कार्बन आइसोटोप सामग्रीद्वारा छुट्याउनुपर्दछ।

वास्तवमा, EPO को लागि विभिन्न परीक्षण विधिहरूमा अझै पनि सीमितताहरू छन्। उदाहरणका लागि, अमेरिकी साइक्लिङ लिजेन्ड लान्स आर्मस्ट्रङले आफ्नो सात टुर डे फ्रान्स विजयहरूमा EPO र अन्य उत्तेजकहरू लिएको स्वीकार गरे, तर वास्तवमा उस समय कुनै पनि डोपिङ परीक्षणमा EPO को लागि सकारात्मक पुष्टि भएको थिएन। हामीले अझै पर्खनु पर्छ र यो "एक फिट अग्लो" वा "एक फिट माथि" हो कि भनेर हेर्नु पर्छ।

यसले नोबेल पुरस्कार कसरी बनाउँछ

EPO र 2019 नोबेल पुरस्कार फिजियोलोजी वा मेडिसिन बीचको सम्बन्धको बारेमा अन्तिम शब्द।

EPO मानव शरीरको धारणा र हाइपोक्सियाको प्रतिक्रियाको सबैभन्दा सामान्य केस हो। तसर्थ, सेमेन्जा र रेटक्लिफ, दुई नोबेल पुरस्कार विजेताहरूले कोशिकाको धारणा र हाइपोक्सियामा अनुकूलनको संयन्त्र अध्ययन गर्न EPO लाई सुरुवात बिन्दुको रूपमा रोजे। पहिलो चरण ईपीओ जीनको तत्वहरू फेला पार्नु थियो जसले अक्सिजन परिवर्तनहरूमा प्रतिक्रिया दिन सक्छ। सेमेन्जाले जीन एन्कोडिङ ईपीओको 3 'डाउनस्ट्रीम अन्त्यमा मुख्य 256-बेस गैर-कोडिङ अनुक्रम पहिचान गर्‍यो, जसलाई हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया तत्व भनिन्छ। यदि यो तत्व अनुक्रम उत्परिवर्तित वा मेटाइएको छ भने, हाइपोक्सियामा प्रतिक्रिया गर्ने EPO प्रोटीनको क्षमता धेरै कम हुन्छ। यदि यो तत्व अनुक्रम हाइपोक्सियासँग सम्बन्धित नभएको अन्य जीनहरूको डाउनस्ट्रीम 3 'अन्तमा फ्यूज गरिएको छ भने, यी परिमार्जित जीनहरूले EPO-जस्तो सक्रियता पनि देखाउँछन्।हाइपोक्सिया अवस्था अन्तर्गत।

रेटक्लिफ र उनको टोलीले त्यसपछि पत्ता लगाए कि यो हाइपोक्सिक प्रतिक्रिया तत्व EPO को उत्पादनको लागि जिम्मेवार मृगौला वा कलेजो कोशिकाहरूमा मात्र होइन, तर हाइपोक्सिक अवस्थाहरूमा काम गर्न सक्ने अन्य धेरै कोशिकाहरूमा पनि हुन्छ। अर्को शब्दमा, हाइपोक्सियाको यो प्रतिक्रिया EPO को लागि विशिष्ट नहुन सक्छ, तर कोशिकाहरूमा अझ व्यापक घटना हुन सक्छ। यी अन्य कोशिकाहरू, जो EPO उत्पादनको लागि जिम्मेवार छैनन्, अणुहरू (जस्तै जीन अभिव्यक्ति सक्रिय गर्न जिम्मेवार ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू) समावेश हुनुपर्छ जसले अक्सिजन एकाग्रतामा परिवर्तनहरू महसुस गर्छ र EPO जस्ता जीनहरू सक्रिय गर्न हाइपोक्सिक प्रतिक्रिया तत्वहरूमा बाँध्छ।