Die drie wenners van die 2019 Nobelprys in Fisiologie of Geneeskunde, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza en sir Peter J. Ratcliffe het reeds die 2016 Lasker-prys in Basiese Geneeskunde gewen vir hul werk oor hoe selle voel en aanpas. tot hipoksie, so dit was nie besonder verbasend nie. Hulle het die sleutelmolekule-hipoksie-induseerbare faktor 1 (HIF-1) ontdek en geïdentifiseer. Vandag wil ons teruggaan na die oorsprong van die studie, wat eritropoïetien, of EPO, 'n wondermolekule is.
Dit is die belangrikste faktor in die produksie van rooibloedselle
Rooibloedselle is die volopste tipe bloedselle in die bloed, en is die hoofmedium vir die vervoer van suurstof en koolstofdioksied deur die bloed van gewerwelde diere. Eritrosiete word in die beenmurg gegenereer: Hematopoëtiese stamselle prolifereer eers en differensieer in stamvaders van verskeie bloedselle, en eritroïede stamselle kan verder differensieer en verouder tot eritrosiete. Onder normale toestande is menslike eritrosietproduksietempo baie laag, maar onder stres soos bloeding, hemolise en hipoksie kan die tempo van eritrosietproduksie met tot agt keer verhoog word. In hierdie proses is eritropoïetien EPO een van die belangrikste faktore.
EPO is 'n hormoon wat hoofsaaklik in die niere gesintetiseer word. Die chemiese aard daarvan is 'n hoogs geglikosileerde proteïen. Hoekom in die niere? Ongeveer 'n liter bloed vloei elke minuut deur die niere, sodat hulle vinnig en doeltreffend veranderinge in suurstofvlakke in die bloed kan opspoor. Wanneer suurstofvlakke in die bloed laag is, reageer die niere vinnig en produseer groot hoeveelhede EPO. Laasgenoemde sirkuleer deur die bloedstroom na die beenmurg, waar dit die omskakeling van eritroïede stamvaderselle in rooibloedselle bevorder. Volwasse rooibloedselle word uit die beenmurg in die bloedsomloopstelsel vrygestel om die liggaam se vermoë om aan suurstof te bind, te verbeter. Wanneer die niere 'n toename in suurstof in die bloed voel, verminder hulle EPO-produksie, wat weer die hoeveelheid rooibloedselle in die beenmurg verminder.
Dit maak 'n perfekte aanpassingslus. Mense wat op hoë hoogte woon en sommige pasiënte met bloedarmoede ervaar egter dikwels die toestand van voortdurend lae suurstofvlak in die bloed, wat nie die bogenoemde sirkulasie kan voltooi nie en die nier kan stimuleer om voortdurend EPO af te skei, sodat die bloed EPO-konsentrasie hoër is as gewone mense.
Dit het byna 80 jaar geneem om dit te ontbloot
Soos baie groot ontdekkings, het wetenskaplikes se begrip van EPO nie glad verloop nie, met vrae en uitdagings langs die pad. Dit het byna 80 jaar geneem vanaf die konsep van EPO tot die finale bepaling van die spesifieke molekule.
In 1906 het Franse wetenskaplikes Carnot en Deflandre normale konyne ingespuit met die serum van anemiese konyne en gevind dat die rooibloedseltelling in die plasma van normale konyne toegeneem het. Hulle het geglo dat sommige humorale faktore in die plasma die produksie van rooibloedselle kan stimuleer en reguleer. Dit was die eerste EPO konsep prototipe. Ongelukkig is die resultate nie in die daaropvolgende dekades herhaal nie, hoofsaaklik omdat die telling van nuwe rooibloedselle nie akkuraat was nie.
Reissmann en Ruhenstroth-Bauer se parabiose-eksperiment in 1950 het werklik sterk bewyse gelewer. Hulle het die bloedsomloopstelsels van twee lewende rotte chirurgies verbind, die een in 'n hipoksiese omgewing geplaas en die ander een wat normale lug inasem. As gevolg hiervan het beide muise massiewe hoeveelhede rooibloedselle geproduseer. Daar is geen twyfel dat daar 'n hormoon in die bloedstroom is wat die produksie van rooibloedselle stimuleer, waarvan EPO sy naam kry. Aan die ander kant is EPO baie sensitief vir hipoksie.
Watter molekule is EPO? Dit het die Amerikaanse wetenskaplike Goldwasser 30 jaar geneem om die probleem uiteindelik op biochemiese vlak op te klaar. As ’n werker goeie werk wil doen, moet hy eers sy gereedskap slyp. Die funksie van EPO is om nuwe rooibloedselle te stimuleer, maarlaasgenoemde se telling is nie akkuraat nie. Die belangrikste funksionele molekule in rooibloedselle is hemoglobienbevattende heem, wat 'n ysterioon in sy middel bevat. Goldwasser se span het dus pasgebore rooibloedselle met radioaktiewe ysterisotope gemerk en 'n sensitiewe metode ontwikkel om EPO-aktiwiteit op te spoor. Dit maak dit moontlik om baie lae konsentrasies EPO (nanogram per milliliter) uit dierevloeistofmonsters te isoleer en te suiwer. Maar die isolasie van EPO was uiters moeilik. Hulle het oorgeskakel van nier- na anemiese skaapplasma, na die urine van pasiënte met ernstige ystertekort as gevolg van haakwurmbesmetting, en uiteindelik, in 1977, gesuiwer 8 milligram menslike EPO-proteïen uit 2 550 liter urine van Japannese pasiënte met aplastiese anemie.
In 1985 is die proteïenvolgordebepaling en geenkloning van menslike EPO voltooi. Die EPO-geen kodeer vir 'n polipeptied met 193 aminoresidu, wat 'n volwasse proteïen word wat uit 166 aminosuurreste bestaan nadat die seinpeptied tydens afskeiding geknip is, en bevat 4 plekke vir glikosileringsmodifikasie. In 1998 is die KMR-oplossingstruktuur van EPO en die kristalstruktuur van EPO en sy reseptorkompleks ontleed. Op hierdie stadium het mense die mees intuïtiewe begrip van EPO.
Tot nou toe het behandeling vir anemie gewoonlik bloedoortappings vereis om die tekort aan rooibloedselle aan te vul. Soos mense meer oor EPO leer, het die inspuiting daarvan om rooibloedselproduksie in hul eie beenmurg te stimuleer die probleem makliker gemaak. Maar om EPO direk uit liggaamsvloeistowwe te suiwer, soos Goldwasser gedoen het, is moeilik en opbrengste is laag. Die bepaling van EPO-proteïen en geenvolgorde het dit moontlik gemaak om rekombinante menslike EPO in groot hoeveelhede te produseer.
Dit is gedoen deur 'n biotegnologie-maatskappy genaamd Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen is in 1980 met net sewe lede gestig, met die hoop om biofarmaseutiese middels te maak met die destyds opkomende tegnieke van molekulêre biologie. Interferon, groeihormoonvrystellingsfaktor, hepatitis B-entstof, epidermale groeifaktor was van die warm name op hul lys van teikens, maar nie een van hierdie pogings het geslaag nie. Tot 1985 het Lin Fukun, 'n Chinese wetenskaplike van Taiwan, China, die geen van menslike EPO gekloon, en toe die produksie van sintetiese EPO met behulp van DNA-rekombinasietegnologie besef.
Rekombinante menslike EPO het dieselfde volgorde as endogene EPO-proteïen, en het ook soortgelyke glikosileringsmodifikasie. Natuurlik het rekombinante menslike EPO ook die aktiwiteit van endogene EPO. In Junie 1989 is Amgen se eerste produk, rekombinante menslike eritropoïetien Epogen, deur die Amerikaanse FDA goedgekeur vir die behandeling van anemie wat veroorsaak word deur chroniese nierversaking en bloedarmoede in die behandeling van MIV-infeksie. Epogen-verkope het in net drie maande meer as $16 miljoen bereik. Oor die volgende twee dekades het Amgen die mark vir hersaamgestelde menslike EPO oorheers. Epogen het Amgen $2,5 miljard se inkomste in 2010 alleen gebring. In 2018 was Amgen se aandelemarkwaarde $128,8 miljard, wat dit die agtste grootste farmaseutiese maatskappy ter wêreld maak.
Dit is opmerklik dat Amgen aanvanklik saam met Goldwasser gewerk het om gesuiwerde menslike EPO-proteïene vir volgordebepaling te verskaf, maar Goldwasser en Amgen het gou uitgesak weens ideologiese verskille. Goldwasser en sy Universiteit van Chicago, wat basiese navorsing gedoen het, het nooit gedink om die hormoon wat hy ontdek het te patenteer nie, en het dus nie 'n sent vir EPO se groot kommersiële sukses ontvang nie.
Dit -- hoe is dit 'n stimulant
Wanneer ons asemhaal, gaan suurstof die selle se mitochondria binne om die respiratoriese ketting aan te dryf en massiewe hoeveelhede ATP te produseer, die hoofbron van energie in ons liggame. Mense met bloedarmoede het nie genoeg gesonde rooibloedselle nie, en die mees onmiddellike effek is dat hulle nie genoeg suurstof inneem nie, wat hulle moeg laat voel, soortgelyk aan asemhalingsprobleme tydens 'n lang termyn. Wanneer dit met rekombinante menslike EPO ingespuit word, produseer bloedarmoede pasiënte se liggame meer rooibloedselle,dra meer suurstof, en produseer meer van die energiemolekule ATP, wat effektief simptome verlig.
Sommige sportwerkers het egter ook aan rekombinante menslike EPO begin dink. As die kunsmatige rekombinante hormoon van EPO-tipe gebruik word om die atlete se liggaam te stimuleer om meer rooibloedselle te produseer, is dit moontlik om die atlete se vermoë om suurstof te verkry en energiemolekules te produseer, wat ook die prestasie van atlete in uithouvermoë kan verbeter, verbeter geleenthede soos fietsry, langafstandhardloop en landloop. ’n Referaat uit 1980 in die Journal of Applied Physiology het getoon dat bloedstimulante (eritropoïetien, kunsmatige suurstofdraers en bloedoortappings) uithouvermoë met 34 persent kan verhoog. As atlete die EPO gebruik, kan hulle 8 kilometer op die trapmeul hardloop in 44 sekondes minder tyd as voorheen. Trouens, fietsry en marathons was die ergste oortreders vir EPO-stimulante. Tydens die 1998 Tour de France is 'n Spaanse spandokter vir die Festina-span by die Franse grens in hegtenis geneem met 400 bottels kunsmatige rekombinante EPO! Die gevolg was natuurlik dat die hele span uit die toer geskop en verban is.
Die Internasionale Olimpiese Komitee het EPO by sy verbode lys by die 1992 Barcelona Spele gevoeg, maar die herorganisering van menslike EPO-toetsing was so moeilik dat daar voor die 2000 Spele geen manier was om effektief vas te stel of atlete dit gebruik nie. Daar is verskeie redes: 1) EPO inhoud in liggaamsvloeistowwe is baie laag, en EPO per ml bloed in normale mense is ongeveer 130-230 nanogram; 2) Die aminosuursamestelling van kunsmatige rekombinante EPO is presies dieselfde as dié van menslike endogene EPO-proteïen, slegs die vorm van glikosilering verskil baie effens; 3) Die halfleeftyd van EPO in die bloed is slegs 5-6 uur, en dit is oor die algemeen onopspoorbaar 4-7 dae na die laaste inspuiting; 4) Die individuele EPO-vlak is baie anders, so dit is moeilik om 'n absolute kwantitatiewe standaard daar te stel.
Sedert 2000 het WADA urinetoetsing gebruik as die enigste wetenskaplike verifikasiemetode vir direkte opsporing van rekombinante EPO. As gevolg van die geringe verskille tussen die geglikoyleerde vorm van die kunsmatige rekombinante EPO en dié van die menslike EPO, is die gelaaide eienskappe van die twee molekules baie klein en kan dit onderskei word deur 'n elektroforesemetode genaamd iso-elektriese fokusering, wat die hoofstrategie vir die direkte opsporing van die kunsmatige rekombinante EPO. Sommige rekombinante EPO uitgedruk deur menslike afgeleide selle het egter geen verskil in glikosilering getoon nie, so sommige kenners het voorgestel dat eksogene EPO en endogene EPO deur verskillende koolstofisotoop-inhoud onderskei moet word.
Trouens, daar is steeds beperkings in verskillende toetsmetodes vir EPO. Lance Armstrong, die Amerikaanse fietsrylegende, het byvoorbeeld erken dat hy EPO en ander opkikkers geneem het tydens sy sewe Tour de France-oorwinnings, maar hy is op daardie stadium nie eintlik positief vir EPO in enige dopingtoets bevestig nie. Ons moet nog wag en sien of dit “een voet hoër” of “een voet hoër” is.
Hoe maak dit 'n Nobelprys
'n Laaste woord oor die verband tussen EPO en die 2019 Nobelprys in Fisiologie of Geneeskunde.
EPO is die mees tipiese geval van menslike liggaam se persepsie en reaksie op hipoksie. Daarom het Semenza en Ratcliffe, twee Nobelpryswenners, EPO as die beginpunt gekies om die meganisme van selpersepsie en aanpassing by hipoksie te bestudeer. Die eerste stap was om die elemente van EPO-geen te vind wat op suurstofveranderinge kan reageer. Semenza het 'n sleutel 256-basis nie-koderende volgorde geïdentifiseer aan die 3 'stroomafkant van die geen wat EPO kodeer, genaamd die hipoksie-reaksie-element. As hierdie elementvolgorde gemuteer of geskrap word, word die EPO-proteïen se vermoë om op hipoksie te reageer aansienlik verminder. As hierdie elementvolgorde saamgesmelt word aan die stroomafwaartse 3'-kant van ander gene wat nie met hipoksie geassosieer word nie, toon hierdie gemodifiseerde gene ook EPO-agtige aktiveringonder hipoksie toestande.
Ratcliffe en sy span het toe ontdek dat hierdie hipoksiese reaksie-element nie net teenwoordig is in die nier- of lewerselle wat verantwoordelik is vir die produksie van EPO nie, maar ook in baie ander seltipes wat onder hipoksiese toestande kan funksioneer. Met ander woorde, hierdie reaksie op hipoksie is dalk nie spesifiek vir EPO nie, maar eerder 'n meer wydverspreide verskynsel in selle. Hierdie ander selle, wat nie verantwoordelik is vir EPO-produksie nie, moet molekules bevat (soos transkripsiefaktore wat verantwoordelik is vir die aanskakel van geenuitdrukking) wat veranderinge in suurstofkonsentrasie waarneem en aan hipoksiese reaksie-elemente bind om gene soos EPO aan te skakel.
