فاز الفائزون الثلاثة بجائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب لعام 2019 ، ويليام جي كيلين جونيور ، وجريج إل سيمينزا ، والسير بيتر ج. إلى نقص الأكسجين ، لذلك لم يكن الأمر مفاجئًا بشكل خاص. اكتشفوا وحدد العامل الجزيئي المحفز لنقص الأكسجة 1 (HIF-1). اليوم نريد العودة إلى أصل الدراسة ، وهو الإريثروبويتين ، أو EPO ، وهو جزيء معجزة.

إنه أهم عامل في إنتاج خلايا الدم الحمراء

خلايا الدم الحمراء هي أكثر أنواع خلايا الدم وفرة في الدم ، وهي الوسيلة الرئيسية لنقل الأكسجين وثاني أكسيد الكربون عبر دم الفقاريات. تتولد كريات الدم الحمراء في نخاع العظام: تتكاثر الخلايا الجذعية المكونة للدم أولاً وتتمايز إلى أسلاف لخلايا الدم المختلفة ، ويمكن لأسلاف الكريات الحمر أن تتمايز وتنضج إلى كريات الدم الحمراء. في ظل الظروف العادية ، يكون معدل إنتاج كرات الدم الحمراء البشرية منخفضًا جدًا ، ولكن تحت الضغط مثل النزيف وانحلال الدم ونقص الأكسجة ، يمكن زيادة معدل إنتاج كرات الدم الحمراء بما يصل إلى ثمانية أضعاف. في هذه العملية ، يعتبر erythropoietin EPO أحد أهم العوامل.

EPO هو هرمون يتم تصنيعه بشكل رئيسي في الكلى. طبيعته الكيميائية هي بروتين عالي الجليكوزيلات. لماذا في الكلى؟ يتدفق حوالي لتر من الدم عبر الكلى كل دقيقة ، حتى يتمكنوا من اكتشاف التغيرات في مستويات الأكسجين في الدم بسرعة وكفاءة. عندما تكون مستويات الأكسجين في الدم منخفضة ، تستجيب الكلى بسرعة وتنتج كميات كبيرة من EPO. ينتقل الأخير عبر مجرى الدم إلى نخاع العظم ، حيث يشجع على تحويل الخلايا السلفية للكريات الحمر إلى خلايا الدم الحمراء. يتم إطلاق خلايا الدم الحمراء الناضجة من نخاع العظام إلى الدورة الدموية لتحسين قدرة الجسم على الارتباط بالأكسجين. عندما تشعر الكلى بزيادة الأكسجين في الدم ، فإنها تقلل من إنتاج EPO ، والذي بدوره يقلل من كمية خلايا الدم الحمراء في نخاع العظام.

هذا يجعل حلقة ضبط مثالية. ومع ذلك ، فإن الأشخاص الذين يعيشون على ارتفاعات عالية وبعض مرضى فقر الدم غالبًا ما يواجهون حالة انخفاض مستمر في مستوى الأكسجين في الدم ، والتي لا يمكنها إكمال الدورة الدموية المذكورة أعلاه وتحفيز الكلى على إفراز EPO باستمرار ، بحيث يكون تركيز EPO في الدم أعلى من الأشخاص العاديين.

استغرق الأمر ما يقرب من 80 عامًا للكشف عنها

مثل العديد من الاكتشافات الكبرى ، لم يكن فهم العلماء للمكتب الأوروبي للبراءات سلسًا ، مع وجود أسئلة وتحديات على طول الطريق. استغرق الأمر ما يقرب من 80 عامًا من مفهوم المكتب الأوروبي للبراءات إلى التحديد النهائي للجزيء المحدد.

في عام 1906 ، قام العالمان الفرنسيان كارنو وديفلاندر بحقن الأرانب الطبيعية بمصل الأرانب المصابة بفقر الدم ووجدوا أن عدد خلايا الدم الحمراء في بلازما الأرانب الطبيعية زاد. كانوا يعتقدون أن بعض العوامل الخلطية في البلازما يمكن أن تحفز وتنظيم إنتاج خلايا الدم الحمراء. كان هذا أول نموذج أولي لمفهوم المكتب الأوروبي للبراءات. لسوء الحظ ، لم يتم تكرار النتائج في العقود اللاحقة ، ويرجع ذلك أساسًا إلى عدم دقة عدد خلايا الدم الحمراء الجديدة.

قدمت تجربة Reissmann و Ruhenstroth-Bauer Parabiosis في عام 1950 دليلًا قويًا حقًا. لقد ربطوا جراحيًا أنظمة الدورة الدموية لاثنين من الفئران الحية ، ووضعوا أحدهما في بيئة ناقصة الأكسجين والآخر يتنفس الهواء الطبيعي. نتيجة لذلك ، أنتج كلا الفئران كميات هائلة من خلايا الدم الحمراء. لا شك أن هناك هرمونًا في مجرى الدم يحفز إنتاج خلايا الدم الحمراء ، ومنه حصل المكتب الأوروبي للبراءات على اسمه. من ناحية أخرى ، فإن المكتب الأوروبي للبراءات حساس للغاية لنقص الأكسجة.

ما هو جزيء EPO؟ استغرق الأمر من العالم الأمريكي جولدفاسر 30 عامًا لتوضيح المشكلة أخيرًا على المستوى البيوكيميائي. إذا أراد العامل القيام بعمل جيد ، فعليه أولاً شحذ أدواته. وظيفة المكتب الأوروبي للبراءات هي تحفيز خلايا الدم الحمراء الجديدة ، ولكنالعد الأخير غير دقيق. أهم جزيء وظيفي في خلايا الدم الحمراء هو الهيموجلوبين الذي يحتوي على الهيم ، والذي يحتوي في وسطه على أيون حديد. لذلك قام فريق جولدواسر بتسمية خلايا الدم الحمراء حديثي الولادة بنظائر الحديد المشعة وطوروا طريقة حساسة للكشف عن نشاط EPO. هذا يجعل من الممكن عزل وتنقية تركيزات منخفضة جدا من EPO (نانوجرام لكل مليلتر) من عينات السائل الحيواني. لكن عزل المكتب الأوروبي للبراءات كان شديد الصعوبة. لقد تحولوا من الكلى إلى بلازما الأغنام التي تعاني من فقر الدم ، إلى بول المرضى الذين يعانون من نقص حاد في الحديد بسبب الإصابة بالديدان الخطافية ، وأخيراً ، في عام 1977 ، قاموا بتنقية 8 ملليغرام من بروتين EPO البشري من 2550 لتراً من البول من المرضى اليابانيين المصابين بفقر الدم اللاتنسجي.

في عام 1985 ، تم الانتهاء من تسلسل البروتين واستنساخ الجينات للـ EPO البشري. يقوم جين EPO بتشفير بولي ببتيد مع 193 من البقايا الأمينية ، والذي يصبح بروتينًا ناضجًا يتكون من 166 من بقايا الأحماض الأمينية بعد قطع ببتيد الإشارة أثناء الإفراز ، ويحتوي على 4 مواقع لتعديل الارتباط بالجليكوزيل. في عام 1998 ، تم تحليل بنية حل NMR للـ EPO والبنية البلورية لـ EPO ومجمع مستقبلاته. في هذه المرحلة ، يكون لدى الناس أكثر فهم بديهي لـ EPO.

حتى الآن ، يتطلب علاج فقر الدم عادةً نقل الدم لتعويض نقص خلايا الدم الحمراء. عندما يتعلم الناس المزيد عن المكتب الأوروبي للبراءات ، فإن حقنه لتحفيز إنتاج خلايا الدم الحمراء في نخاع العظام جعل المشكلة أسهل. لكن تنقية EPO مباشرة من سوائل الجسم ، كما فعل Goldwasser ، أمر صعب والعائد منخفض. أتاح تحديد بروتين EPO وتسلسل الجينات إنتاج EPO بشري مؤتلف بكميات كبيرة.

تم إنجازه من قبل شركة للتكنولوجيا الحيوية تسمى Applied Molecular Genetics (Amgen). تم تأسيس Amgen في عام 1980 مع سبعة أعضاء فقط ، على أمل صنع المستحضرات الصيدلانية الحيوية باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية الناشئة آنذاك. كان الإنترفيرون ، عامل إطلاق هرمون النمو ، لقاح التهاب الكبد B ، عامل نمو البشرة من بين الأسماء الساخنة في قائمة أهدافهم ، لكن لم تنجح أي من هذه المحاولات. حتى عام 1985 ، استنسخ لين فوكون ، وهو عالم صيني من تايوان ، الصين ، جين EPO البشري ، ثم أدرك إنتاج EPO الاصطناعي باستخدام تقنية إعادة تركيب الحمض النووي.

لدى EPO البشري المؤتلف نفس تسلسل بروتين EPO الداخلي ، ولديه أيضًا تعديل مماثل للجليكوزيل. وبطبيعة الحال ، فإن المكتب الأوروبي للبراءات البشري المؤتلف لديه أيضًا نشاط المكتب الأوروبي للبراءات الداخلي. في يونيو 1989 ، تمت الموافقة على أول منتج لـ Amgen ، erythropoietin Epogen البشري المؤتلف ، من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لعلاج فقر الدم الناجم عن الفشل الكلوي المزمن وفقر الدم في علاج عدوى فيروس العوز المناعي البشري. تجاوزت مبيعات Epogen 16 مليون دولار في ثلاثة أشهر فقط. على مدى العقدين التاليين ، سيطر Amgen على سوق المكتب الأوروبي للبراءات المعاد تجميعه. جلبت Epogen عائدات Amgen بقيمة 2.5 مليار دولار في عام 2010 وحده. في عام 2018 ، بلغت قيمة سوق الأسهم لشركة Amgen 128.8 مليار دولار ، مما يجعلها ثامن أكبر شركة أدوية في العالم.

من الجدير بالذكر أن Amgen عملت في البداية مع Goldwasser لتوفير بروتينات EPO بشرية نقية للتسلسل ، ولكن سرعان ما سقط Goldwasser و Amgen بسبب الاختلافات الأيديولوجية. لم يفكر غولدفاسر وجامعته في شيكاغو ، اللذان أجروا بحثًا أساسيًا ، في الحصول على براءة اختراع للهرمون الذي اكتشفه ، وبالتالي لم يتلقيا فلسا واحدا مقابل النجاح التجاري الهائل لـ EPO.

هو - كيف هو منبه

عندما نتنفس ، يدخل الأكسجين إلى ميتوكوندريا الخلايا لدفع السلسلة التنفسية وإنتاج كميات هائلة من ATP ، المصدر الرئيسي للطاقة في أجسامنا. لا يمتلك مرضى فقر الدم ما يكفي من خلايا الدم الحمراء السليمة ، والتأثير الفوري هو أنهم لا يأخذون ما يكفي من الأكسجين ، مما يجعلهم يشعرون بالتعب ، على غرار مشاكل التنفس على المدى الطويل. عند حقنها بـ EPO البشري المؤتلف ، تنتج أجسام مرضى فقر الدم المزيد من خلايا الدم الحمراء ،تحمل المزيد من الأكسجين ، وتنتج المزيد من جزيء الطاقة ATP ، مما يخفف الأعراض بشكل فعال.

ومع ذلك ، بدأ بعض العاملين في مجال الرياضة أيضًا في التفكير في EPO البشري المؤتلف. إذا تم استخدام هرمون المؤتلف الاصطناعي من نوع EPO لتحفيز جسم الرياضيين على إنتاج المزيد من خلايا الدم الحمراء ، فمن الممكن تحسين قدرة الرياضيين على الحصول على الأكسجين وإنتاج جزيئات الطاقة ، والتي يمكن أيضًا تحسين أداء الرياضيين في التحمل الأحداث مثل ركوب الدراجات والجري لمسافات طويلة والتزلج الريفي على الثلج. أظهرت ورقة بحثية نُشرت عام 1980 في مجلة علم وظائف الأعضاء التطبيقية أن منشطات الدم (إرثروبويتين وحاملات الأكسجين الاصطناعي وعمليات نقل الدم) يمكن أن تزيد من القدرة على التحمل بنسبة 34 في المائة. إذا كان الرياضيون يستخدمون EPO ، فيمكنهم الركض لمسافة 8 كيلومترات على جهاز المشي في 44 ثانية وقت أقل من ذي قبل. في الواقع ، كان ركوب الدراجات والماراثون من أسوأ المذنبين لمنشطات EPO. أثناء سباق فرنسا للدراجات عام 1998 ، تم القبض على طبيب فريق إسباني لفريق فيستينا على الحدود الفرنسية ومعه 400 زجاجة من مادة EPO المؤتلفة الاصطناعية! كانت النتيجة بالطبع طرد الفريق بأكمله من الجولة وإيقافه.

أضافت اللجنة الأولمبية الدولية المكتب الأوروبي للبراءات إلى قائمتها المحظورة في أولمبياد برشلونة 1992 ، لكن إعادة تنظيم اختبار المكتب الأوروبي للبراءات كان صعبًا للغاية لدرجة أنه قبل أولمبياد 2000 لم تكن هناك طريقة للكشف بشكل فعال عما إذا كان الرياضيون يستخدمونه أم لا. هناك عدة أسباب: 1) محتوى EPO في سوائل الجسم منخفض جدًا ، و EPO لكل مل من الدم لدى الأشخاص الطبيعيين حوالي 130-230 نانوجرام. 2) تكوين الأحماض الأمينية للـ EPO الاصطناعي المؤتلف هو نفسه تمامًا مثل بروتين EPO الداخلي البشري ، فقط شكل الارتباط بالجليكوزيل يختلف قليلاً جدًا ؛ 3) يبلغ عمر النصف للـ EPO في الدم 5-6 ساعات فقط ، ولا يمكن اكتشافه بشكل عام بعد 4-7 أيام من آخر حقنة ؛ 4) يختلف مستوى المكتب الأوروبي للبراءات الفردي اختلافًا كبيرًا ، لذلك من الصعب وضع معيار كمي مطلق.

منذ عام 2000 ، استخدمت الوكالة العالمية لمكافحة المنشطات (WADA) اختبار البول كأسلوب التحقق العلمي الوحيد للكشف المباشر عن EPO المؤتلف. نظرًا للاختلافات الطفيفة بين الشكل glycoylated من EPO المؤتلف الاصطناعي وتلك الخاصة بـ EPO البشري ، فإن الخصائص المشحونة للجزيئين صغيرة جدًا ويمكن تمييزها عن طريق طريقة الرحلان الكهربائي التي تسمى التركيز الكهروضوئي ، وهي الاستراتيجية الرئيسية لـ الكشف المباشر عن EPO المؤتلف الاصطناعي. ومع ذلك ، فإن بعض EPO المؤتلف الذي تعبر عنه الخلايا المشتقة من الإنسان لم يظهر أي اختلاف في الارتباط بالجليكوزيل ، لذلك اقترح بعض الخبراء أنه يجب التمييز بين EPO الخارجي و EPO الداخلي بمحتوى نظائر كربون مختلف.

في الواقع ، لا تزال هناك قيود في طرق الاختبار المختلفة لـ EPO. على سبيل المثال ، اعترف لانس أرمسترونج ، أسطورة ركوب الدراجات الأمريكية ، بأخذ EPO ومنشطات أخرى خلال انتصاراته السبعة في سباق فرنسا للدراجات ، لكن لم يتم تأكيد إصابته فعليًا بـ EPO في أي اختبار للمنشطات في ذلك الوقت. لا يزال يتعين علينا الانتظار ومعرفة ما إذا كانت "قدم واحدة أعلى" أو "قدم واحدة أعلى".

كيف يصنع جائزة نوبل

كلمة أخيرة حول العلاقة بين المكتب الأوروبي للبراءات وجائزة نوبل لعام 2019 في علم وظائف الأعضاء أو الطب.

المكتب الأوروبي للبراءات هو الحالة الأكثر شيوعًا لإدراك جسم الإنسان واستجابته لنقص الأكسجة. لذلك ، اختار سيمينزا وراتكليف ، الحائزان على جائزة نوبل ، المكتب الأوروبي للبراءات كنقطة انطلاق لدراسة آلية إدراك الخلايا والتكيف مع نقص الأكسجة. كانت الخطوة الأولى هي العثور على عناصر جين EPO التي يمكن أن تستجيب لتغيرات الأكسجين. حدد Semenza تسلسلًا أساسيًا غير مشفر من 256 قاعدة في 3 'نهاية المصب من ترميز الجينات EPO ، المسمى عنصر استجابة نقص الأكسجة. إذا تم تحوير تسلسل العنصر هذا أو حذفه ، فإن قدرة بروتين EPO على الاستجابة لنقص الأكسجة تقل بشكل كبير. إذا تم دمج تسلسل العنصر هذا في نهاية المصب 3 'للجينات الأخرى غير المرتبطة بنقص الأكسجة ، فإن هذه الجينات المعدلة تظهر أيضًا تنشيطًا يشبه EPOتحت ظروف نقص الأكسجة.

اكتشف راتكليف وفريقه بعد ذلك أن عنصر الاستجابة ناقص التأكسج هذا ليس موجودًا فقط في خلايا الكلى أو الكبد المسؤولة عن إنتاج EPO ، ولكن أيضًا في العديد من أنواع الخلايا الأخرى التي يمكن أن تعمل في ظل ظروف نقص الأكسجة. بمعنى آخر ، قد لا تكون هذه الاستجابة لنقص الأكسجة خاصة بـ EPO ، ولكنها ظاهرة أكثر انتشارًا في الخلايا. يجب أن تحتوي هذه الخلايا الأخرى ، غير المسؤولة عن إنتاج EPO ، على جزيئات (مثل عوامل النسخ المسؤولة عن تشغيل التعبير الجيني) التي تشعر بالتغيرات في تركيز الأكسجين وترتبط بعناصر الاستجابة ناقصة التأكسج لتشغيل الجينات مثل EPO.