Fiziologiya və ya Tibb üzrə 2019-cu il Nobel Mükafatının üç qalibi William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza və Sir Peter J. Ratcliffe, hüceyrələrin necə hiss etdiyi və uyğunlaşdığına dair işlərinə görə, 2016-cı ilin əsas tibb üzrə Lasker mükafatını qazanmışdı. hipoksiyaya, buna görə də xüsusilə təəccüblü deyildi. Onlar əsas molekul hipoksiyaya səbəb ola bilən amil 1-i (HIF-1) kəşf etdilər və müəyyən etdilər. Bu gün biz tədqiqatın mənşəyinə, yəni eritropoetin və ya möcüzə molekulu olan EPO-ya qayıtmaq istəyirik.

Qırmızı qan hüceyrələrinin istehsalında ən vacib amildir

Qırmızı qan hüceyrələri qanda ən çox yayılmış qan hüceyrələridir və onurğalıların qanı ilə oksigen və karbon qazının daşınması üçün əsas mühitdir. Eritrositlər sümük iliyində əmələ gəlir: Hematopoetik kök hüceyrələr əvvəlcə çoxalır və müxtəlif qan hüceyrələrinin sələflərinə çevrilir və eritroid sələfləri daha da fərqlənə və eritrositlərə çevrilə bilər. Normal şəraitdə insan eritrosit istehsal sürəti çox aşağıdır, lakin qanaxma, hemoliz və hipoksiya kimi stress altında eritrosit istehsalının sürəti səkkiz dəfəyə qədər artırıla bilər. Bu prosesdə eritropoetin EPO ən vacib amillərdən biridir.

EPO əsasən böyrəklərdə sintez olunan bir hormondur. Onun kimyəvi təbiəti yüksək qlikosilləşdirilmiş zülaldır. Niyə böyrəklərdə? Böyrəklərdən hər dəqiqə təxminən bir litr qan keçir, beləliklə, onlar qanda oksigen səviyyəsində dəyişiklikləri tez və effektiv şəkildə aşkar edə bilirlər. Qanda oksigen səviyyəsi aşağı olduqda, böyrəklər tez reaksiya verir və böyük miqdarda EPO istehsal edir. Sonuncu qan axını ilə sümük iliyinə dolaşır, burada eritroid progenitor hüceyrələrin qırmızı qan hüceyrələrinə çevrilməsinə kömək edir. Yetkin qırmızı qan hüceyrələri bədənin oksigenə bağlanma qabiliyyətini yaxşılaşdırmaq üçün sümük iliyindən qan dövranı sisteminə buraxılır. Böyrəklər qanda oksigenin artdığını hiss etdikdə, EPO istehsalını azaldır, bu da öz növbəsində sümük iliyində qırmızı qan hüceyrələrinin miqdarını azaldır.

Bu, mükəmməl bir tənzimləmə döngəsi edir. Bununla belə, yüksək hündürlükdə yaşayan insanlar və bəzi anemiya xəstələri tez-tez qanda oksigen səviyyəsinin davamlı aşağı olması vəziyyəti ilə qarşılaşırlar ki, bu da yuxarıda göstərilən dövranı tamamlaya bilmir və böyrəyi davamlı olaraq EPO ifraz etmək üçün stimullaşdırır, beləliklə qan EPO konsentrasiyası adi insanlardan daha yüksəkdir.

Onu aşkar etmək üçün təxminən 80 il çəkdi

Bir çox böyük kəşflər kimi, elm adamlarının EPO haqqında anlayışı da yol boyu suallar və çətinliklərlə rəvan olmayıb. EPO konsepsiyasından spesifik molekulun son təyin edilməsinə qədər təxminən 80 il çəkdi.

1906-cı ildə fransız alimləri Karno və Deflandre qansız dovşanların zərdabını normal dovşanlara yeritmiş və normal dovşanların plazmasında qırmızı qan hüceyrələrinin sayının artdığını müəyyən etmişlər. Onlar plazmadakı bəzi humoral amillərin qırmızı qan hüceyrələrinin istehsalını stimullaşdıra və tənzimləyə biləcəyinə inanırdılar. Bu, ilk EPO konseptual prototipi idi. Təəssüf ki, nəticələr sonrakı onilliklərdə təkrarlanmadı, əsasən yeni qırmızı qan hüceyrələrinin sayı dəqiq olmadığı üçün.

1950-ci ildə Reissmann və Ruhenstroth-Bauerin parabioz təcrübəsi həqiqətən güclü dəlillər verdi. Onlar iki canlı siçovulun qan dövranı sistemini cərrahi yolla birləşdirərək, birini hipoksik mühitə, digərini isə normal hava ilə nəfəs almağa yerləşdiriblər. Nəticədə hər iki siçan böyük miqdarda qırmızı qan hüceyrələri istehsal etdi. Şübhə yoxdur ki, qan dövranında qırmızı qan hüceyrələrinin istehsalını stimullaşdıran bir hormon var, EPO adını ondan alır. Digər tərəfdən, EPO hipoksiyaya çox həssasdır.

EPO hansı molekuldur? Problemi biokimyəvi səviyyədə nəhayət aydınlaşdırmaq üçün amerikalı alim Qoldvasser 30 il çəkdi. Əgər fəhlə yaxşı iş görmək istəyirsə, ilk növbədə alətlərini itiləməlidir. EPO funksiyası yeni qırmızı qan hüceyrələrini stimullaşdırmaqdır, lakinsonuncunun sayı dəqiq deyil. Qırmızı qan hüceyrələrinin ən vacib funksional molekulu, mərkəzində dəmir ionu olan hemoglobin ehtiva edir. Beləliklə, Goldwasser komandası yeni doğulmuş qırmızı qan hüceyrələrini radioaktiv dəmir izotopları ilə etiketlədi və EPO fəaliyyətini aşkar etmək üçün həssas bir üsul hazırladı. Bu, heyvan maye nümunələrindən çox aşağı EPO konsentrasiyalarını (mililitrdə nanoqram) təcrid etməyə və təmizləməyə imkan verir. Lakin EPO-nun təcrid olunması son dərəcə çətin idi. Böyrəkdən qansız qoyun plazmasına, qarmaqallı qurd infeksiyası nəticəsində ağır dəmir çatışmazlığı olan xəstələrin sidiklərinə keçdilər və nəhayət, 1977-ci ildə aplastik anemiyalı yapon xəstələrinin 2550 litr sidiyindən 8 milliqram insan EPO zülalını təmizlədilər.

1985-ci ildə insan EPO-nun zülal ardıcıllığı və gen klonlaşdırılması tamamlandı. EPO geni 193 amin qalıqları olan bir polipeptidi kodlayır, ifraz zamanı siqnal peptidi kəsildikdən sonra 166 amin turşusu qalıqlarından ibarət yetkin zülala çevrilir və qlikozilləşmənin modifikasiyası üçün 4 yer ehtiva edir. 1998-ci ildə EPO-nun NMR məhlul strukturu və EPO-nun kristal quruluşu və onun reseptor kompleksi təhlil edilmişdir. Bu nöqtədə insanlar EPO haqqında ən intuitiv anlayışa sahibdirlər.

İndiyə qədər anemiyanın müalicəsi adətən qırmızı qan hüceyrələrinin çatışmazlığını doldurmaq üçün qan köçürülməsini tələb edirdi. İnsanlar EPO haqqında daha çox öyrəndikcə, öz sümük iliyində qırmızı qan hüceyrələrinin istehsalını stimullaşdırmaq üçün onu inyeksiya etmək problemi asanlaşdırdı. Lakin Qoldvasserin etdiyi kimi EPO-nu birbaşa bədən mayelərindən təmizləmək çətindir və məhsuldarlıq aşağıdır. EPO zülalının və gen ardıcıllığının təyini böyük miqdarda rekombinant insan EPO istehsal etməyə imkan verdi.

Bu, Applied Molecular Genetics (Amgen) adlı biotexnologiya şirkəti tərəfindən edilib. Amgen 1980-ci ildə yalnız yeddi üzvü ilə qurulmuşdur və o zamanlar molekulyar biologiyanın yeni üsulları ilə biofarmasevtiklər hazırlamaq ümidi ilə yaradılmışdır. İnterferon, böyümə hormonu ifraz edən faktor, hepatit B peyvəndi, epidermal böyümə faktoru hədəflər siyahısında qaynar adlar arasında idi, lakin bu cəhdlərin heç biri uğur qazanmadı. 1985-ci ilə qədər Çinin Tayvanlı alimi Lin Fukun insan EPO-nun genini klonladı və sonra DNT rekombinasiya texnologiyasından istifadə edərək sintetik EPO istehsalını reallaşdırdı.

Rekombinant insan EPO-su endogen EPO proteini ilə eyni ardıcıllığa malikdir və eyni zamanda oxşar qlikozilləşmə modifikasiyasına malikdir. Təbii ki, rekombinant insan EPO da endogen EPO aktivliyinə malikdir. 1989-cu ilin iyun ayında Amgenin ilk məhsulu olan rekombinant insan eritropoietin Epogen ABŞ FDA tərəfindən xroniki böyrək çatışmazlığının səbəb olduğu anemiyanın və HİV infeksiyasının müalicəsində anemiyanın müalicəsi üçün təsdiq edilmişdir. Epogen satışları cəmi üç ayda 16 milyon dolları keçdi. Növbəti iki onillikdə Amgen yenidən yığılmış insan EPO bazarında üstünlük təşkil etdi. Epogen təkcə 2010-cu ildə Amgenə 2,5 milyard dollar gəlir gətirdi. 2018-ci ildə Amgenin birja dəyəri 128,8 milyard dollar təşkil edərək, onu dünyanın səkkizinci ən böyük əczaçılıq şirkəti etdi.

Qeyd etmək lazımdır ki, Amgen əvvəlcə sıralama üçün təmizlənmiş insan EPO zülallarını təmin etmək üçün Goldwasser ilə işlədi, lakin Qoldvasser və Amgen ideoloji fərqlər səbəbindən tezliklə ayrıldılar. Qoldvasser və əsas tədqiqatlar aparan Çikaqo Universiteti, kəşf etdiyi hormonu patentləşdirməyi heç düşünməmişdilər və buna görə də EPO-nun böyük kommersiya uğuru üçün bir qəpik də almamışdılar.

Bu necə bir stimuldur

Nəfəs aldığımız zaman oksigen tənəffüs zəncirini hərəkətə gətirmək və bədənimizdəki əsas enerji mənbəyi olan böyük miqdarda ATP istehsal etmək üçün hüceyrələrin mitoxondrilərinə daxil olur. Anemiyalı insanlarda kifayət qədər sağlam qırmızı qan hüceyrələri yoxdur və ən ani təsir, uzun müddət ərzində nəfəs alma problemlərinə bənzər şəkildə yorğunluq hissi yaradan kifayət qədər oksigen qəbul etməmələridir. Rekombinant insan EPO enjekte edildikdə, anemiya xəstələrinin bədənləri daha çox qırmızı qan hüceyrəsi istehsal edir,daha çox oksigen daşıyır və daha çox enerji molekulu ATP istehsal edərək simptomları effektiv şəkildə aradan qaldırır.

Bununla belə, bəzi idman işçiləri də rekombinant insan EPO haqqında düşünməyə başladılar. EPO tipli süni rekombinant hormon idmançıların bədənini daha çox qırmızı qan hüceyrəsi istehsal etmək üçün stimullaşdırmaq üçün istifadə edilərsə, idmançıların oksigen əldə etmək və enerji molekulları istehsal etmək qabiliyyətini yaxşılaşdırmaq mümkündür ki, bu da idmançıların dözümlülük performansını yaxşılaşdıra bilər. velosiped sürmə, uzun məsafəyə qaçış və xizək sürmə kimi tədbirlər. Journal of Applied Physiology-də 1980-ci ildə dərc edilmiş bir məqalə göstərdi ki, qan stimulyatorları (eritropoetin, süni oksigen daşıyıcıları və qan köçürmələri) dözümlülüyü 34 faiz artıra bilir. Əgər idmançılar EPO-dan istifadə etsələr, onlar treadmildə əvvəlkindən 44 saniyə az vaxta 8 kilometr qaça bilərlər. Əslində, velosiped və marafonlar EPO stimulantları üçün ən pis cinayətlər olmuşdur. 1998-ci il Tour de France yarışı zamanı Festina komandasının İspan komandasının həkimi Fransa sərhədində 400 şüşə süni rekombinant EPO ilə həbs olundu! Nəticə, əlbəttə ki, bütün komandanın Turdan qovulması və qadağan edilməsi oldu.

Beynəlxalq Olimpiya Komitəsi 1992-ci il Barselona Oyunlarında EPO-nu qadağan olunmuş siyahısına əlavə etdi, lakin insan EPO testini yenidən təşkil etmək o qədər çətin idi ki, 2000-ci il Oyunlarından əvvəl idmançıların ondan istifadə edib-etmədiyini effektiv şəkildə aşkar etmək üçün heç bir yol yox idi. Bir neçə səbəb var: 1) Bədən mayelərində EPO miqdarı çox aşağıdır və normal insanlarda hər ml qanda EPO təxminən 130-230 nanoqramdır; 2) Süni rekombinant EPO-nun amin turşusu tərkibi insanın endogen EPO zülalının tərkibi ilə tam eynidir, yalnız qlikozilləşmə forması çox az fərqlidir; 3) EPO-nun qanda yarımxaricolma dövrü cəmi 5-6 saatdır və sonuncu inyeksiyadan 4-7 gün sonra ümumiyyətlə aşkar edilmir; 4) Fərdi EPO səviyyəsi çox fərqlidir, ona görə də mütləq kəmiyyət standartı yaratmaq çətindir.

2000-ci ildən WADA rekombinant EPO-nun birbaşa aşkarlanması üçün yeganə elmi yoxlama metodu kimi sidik testindən istifadə edir. Süni rekombinant EPO-nun qlikollaşdırılmış forması ilə insan EPO-nunki arasında cüzi fərqlər olduğuna görə, iki molekulun yüklü xüsusiyyətləri çox kiçikdir və onları izoelektrik fokuslama adlanan elektroforez üsulu ilə ayırd etmək olar. süni rekombinant EPO-nun birbaşa aşkarlanması. Bununla belə, insan törəmə hüceyrələri tərəfindən ifadə edilən bəzi rekombinant EPO qlikozilləşmədə heç bir fərq göstərməmişdir, buna görə də bəzi ekspertlər ekzogen EPO və endogen EPO-nun müxtəlif karbon izotop məzmunu ilə fərqləndirilməsini təklif etdilər.

Əslində, EPO üçün müxtəlif test üsullarında hələ də məhdudiyyətlər var. Məsələn, Amerika velosipedçilərinin əfsanəsi Lance Armstronq, Tour de France-da yeddi qələbəsi zamanı EPO və digər stimullaşdırıcı maddələr qəbul etdiyini etiraf etdi, lakin o zaman heç bir dopinq testində EPO üçün müsbət nəticə vermədi. Hələ gözləyək və görməliyik ki, “bir ayaq hündürdür”, yoxsa “bir ayaq hündür”.

Necə Nobel mükafatı alır

EPO ilə Fiziologiya və Tibb üzrə 2019 Nobel Mükafatı arasındakı əlaqə haqqında son söz.

EPO, insan orqanizminin hipoksiyaya reaksiyasının ən tipik halıdır. Buna görə də, iki Nobel mükafatı laureatı Semenza və Ratcliffe hüceyrələrin qavranılması və hipoksiyaya uyğunlaşma mexanizmini öyrənmək üçün başlanğıc nöqtəsi kimi EPO-nu seçdilər. İlk addım oksigen dəyişikliklərinə cavab verə bilən EPO geninin elementlərini tapmaq idi. Semenza, hipoksiyaya cavab elementi adlanan EPO kodlayan genin 3 'aşağı axın sonunda əsas 256 əsaslı kodlaşdırılmayan ardıcıllığı müəyyən etdi. Bu element ardıcıllığı mutasiyaya uğrayarsa və ya silinərsə, EPO zülalının hipoksiyaya cavab vermək qabiliyyəti əhəmiyyətli dərəcədə azalır. Bu element ardıcıllığı hipoksiya ilə əlaqəli olmayan digər genlərin aşağı axın 3 'ucu ilə birləşdirilirsə, bu dəyişdirilmiş genlər də EPO-ya bənzər aktivasiya göstərir.hipoksiya şəraitində.

Ratcliffe və onun komandası daha sonra kəşf etdilər ki, bu hipoksik reaksiya elementi yalnız EPO istehsalına cavabdeh olan böyrək və ya qaraciyər hüceyrələrində deyil, həm də hipoksik şəraitdə fəaliyyət göstərə bilən bir çox digər hüceyrə tiplərində mövcuddur. Başqa sözlə, hipoksiyaya bu reaksiya EPO-ya xas olmaya bilər, əksinə hüceyrələrdə daha geniş yayılmış bir fenomendir. EPO istehsalına cavabdeh olmayan bu digər hüceyrələr oksigen konsentrasiyasındakı dəyişiklikləri hiss edən və EPO kimi genləri işə salmaq üçün hipoksik reaksiya elementlərinə bağlanan molekulları (gen ifadəsini işə salmaq üçün məsul olan transkripsiya faktorları kimi) ehtiva etməlidir.