Тры лаўрэаты Нобелеўскай прэміі па фізіялогіі і медыцыне 2019 года Уільям Г. Кейлін-малодшы, Грэг Л. Семенца і сэр Пітэр Дж. Рэткліф ужо атрымалі прэмію Ласкера па фундаментальнай медыцыне 2016 года за працу над тым, як клеткі адчуваюць і адаптуюцца да гіпаксіі, так што гэта не было асабліва дзіўна. Яны выявілі і ідэнтыфікавалі ключавую малекулу фактар ​​1, выкліканага гіпаксіяй (HIF-1). Сёння мы хочам вярнуцца да вытокаў даследавання, якім з'яўляецца эрытрапаэтын, або ЭПО, цудадзейная малекула.

Гэта самы важны фактар ​​у вытворчасці эрытрацытаў

Эрытрацыты з'яўляюцца самым распаўсюджаным тыпам крывяных цельцаў у крыві і з'яўляюцца асноўным асяроддзем для транспарціроўкі кіслароду і вуглякіслага газу праз кроў пазваночных жывёл. Эрытрацыты ўтвараюцца ў касцяным мозгу: крывятворныя ствалавыя клеткі спачатку праліферуюць і дыферэнцуюцца ў папярэднікаў розных клетак крыві, а эритроидные клеткі могуць далей дыферэнцавацца і спеюць у эрытрацыты. У нармальных умовах хуткасць выпрацоўкі эрытрацытаў у чалавека вельмі нізкая, але пры стрэсе, такім як крывацёк, гемолізу і гіпаксія, хуткасць выпрацоўкі эрытрацытаў можа павялічвацца да васьмі разоў. У гэтым працэсе эрытрапаэтын ЭПО з'яўляецца адным з найбольш важных фактараў.

ЭПО - гэта гармон, які сінтэзуецца ў асноўным у нырках. Яго хімічная прырода ўяўляе сабой высока гликозилированный бялок. Чаму менавіта ў нырках? Кожную хвіліну праз ныркі працякае каля літра крыві, таму яны могуць хутка і эфектыўна вызначаць змены ўзроўню кіслароду ў крыві. Калі ўзровень кіслароду ў крыві нізкі, ныркі хутка рэагуюць і выпрацоўваюць вялікую колькасць ЭПО. Апошні цыркулюе па крывацёку ў касцяны мозг, дзе спрыяе ператварэнню эритроидных клетак-папярэднікаў у эрытрацыты. Спелыя эрытрацыты вылучаюцца з касцявога мозгу ў крывяносную сістэму, каб палепшыць здольнасць арганізма звязвацца з кіслародам. Калі ныркі адчуваюць павелічэнне кіслароду ў крыві, яны зніжаюць выпрацоўку ЭПО, што, у сваю чаргу, памяншае колькасць эрытрацытаў у касцяным мозгу.

Гэта робіць ідэальную пятлю рэгулявання. Тым не менш, людзі, якія жывуць на вялікай вышыні, і некаторыя пацыенты з анеміяй часта сутыкаюцца з пастаянна нізкім узроўнем кіслароду ў крыві, які не можа завяршыць вышэйзгаданую цыркуляцыю і стымуляваць ныркі да пастаяннай сакрэцыі ЭПО, так што канцэнтрацыя ЭПО ў крыві вышэй, чым у звычайных людзей.

На яго раскрыццё спатрэбілася амаль 80 гадоў

Як і многія буйныя адкрыцці, разуменне EPO навукоўцамі не было гладкім, з пытаннямі і праблемамі на гэтым шляху. Ад канцэпцыі EPO да канчатковага вызначэння канкрэтнай малекулы прайшло амаль 80 гадоў.

У 1906 годзе французскія навукоўцы Карно і Дэфландр ўводзілі нармальным трусам сыроватку трусоў з анеміяй і выявілі, што колькасць эрытрацытаў у плазме нармальных трусоў павялічваецца. Яны лічылі, што некаторыя гумаральныя фактары ў плазме могуць стымуляваць і рэгуляваць выпрацоўку эрытрацытаў. Гэта быў першы прататып канцэпцыі EPO. На жаль, вынікі не былі прайграныя ў наступныя дзесяцігоддзі, галоўным чынам таму, што падлік новых эрытрацытаў быў недакладным.

Эксперымент Рэйсмана і Руэнстрота-Баўэра ў 1950 г. на парабіёз даў сапраўды важкія доказы. Яны хірургічным шляхам злучылі крывяносную сістэму двух жывых пацукоў, змясціўшы аднаго ў гіпаксічнае асяроддзе, а другога дыхаючы нармальным паветрам. У выніку абедзве мышы вырабілі велізарную колькасць эрытрацытаў. Няма сумневу, што ў крывацёку ёсць гармон, які стымулюе выпрацоўку эрытрацытаў, ад чаго EPO і атрымаў сваю назву. З іншага боку, EPO вельмі адчувальны да гіпаксіі.

Якая малекула з'яўляецца EPO? Амерыканскаму навукоўцу Голдвассеру спатрэбілася 30 гадоў, каб канчаткова высветліць праблему на біяхімічным узроўні. Калі рабочы хоча рабіць добрую працу, ён павінен спачатку навастрыць свае прылады. Функцыя EPO - стымуляваць новыя эрытрацыты, алепадлік апошніх не дакладны. Самай важнай функцыянальнай малекулай эрытрацытаў з'яўляецца гемаглабін, які змяшчае гем, у цэнтры якога знаходзіцца іён двухвалентнага жалеза. Такім чынам, каманда Голдвассера пазначыла эрытрацыты нованароджаных радыеактыўнымі ізатопамі жалеза і распрацавала адчувальны метад выяўлення актыўнасці ЭПО. Гэта дазваляе вылучыць і ачысціць вельмі нізкія канцэнтрацыі EPO (нанаграмы на мілілітр) з узораў вадкасцяў жывёл. Але ізаляцыя EPO была надзвычай складанай. Яны перайшлі з нырак на плазму авечак з анеміяй, на мачу пацыентаў з сур'ёзным дэфіцытам жалеза з-за заражэння анкилостомидами, і, нарэшце, у 1977 годзе ачысцілі 8 міліграмаў чалавечага бялку EPO з 2550 літраў мачы японскіх пацыентаў з аплястычнай анеміяй.

У 1985 годзе было завершана секвенирование бялку і кланаванне гена ЭПО чалавека. Ген EPO кадуе поліпептыд з 193 амінакіслотнымі астаткамі, які становіцца сталым бялком, які складаецца з 166 амінакіслотных астаткаў пасля таго, як сігнальны пептыд абразаецца падчас сакрэцыі, і змяшчае 4 сайты для мадыфікацыі гліказілявання. У 1998 годзе была прааналізавана структура раствора ЯМР ЭПВ і крышталічная структура ЭПВ і яго рэцэптарнага комплексу. У гэты момант людзі маюць самае інтуітыўнае разуменне EPO.

Да гэтага часу лячэнне анеміі звычайна патрабавала пералівання крыві для папаўнення дэфіцыту эрытрацытаў. Па меры таго, як людзі даведаюцца больш пра EPO, яго ін'екцыі для стымуляцыі выпрацоўкі эрытрацытаў ва ўласным касцяным мозгу палягчаюць праблему. Але ачыстка EPO непасрэдна з цялесных вадкасцей, як гэта зрабіў Goldwasser, складаная, і выхад нізкі. Вызначэнне бялку EPO і паслядоўнасці гена дазволіла атрымаць рэкамбінантны EPO чалавека ў вялікіх колькасцях.

Гэта было зроблена біятэхналагічнай кампаніяй пад назвай Applied Molecular Genetics (Amgen). Кампанія Amgen была заснавана ў 1980 годзе толькі з сямі членаў у надзеі вырабляць біяфармацэўтычныя прэпараты з дапамогай новых метадаў малекулярнай біялогіі. Інтэрферон, рилизинг-фактар ​​гармону росту, вакцына супраць гепатыту В, эпідэрмальны фактар ​​росту былі аднымі з гарачых імёнаў у іх спісе мішэняў, але ні адна з гэтых спроб не ўвянчалася поспехам. Да 1985 года Лінь Фукунь, кітайскі навуковец з Тайваня, Кітай, кланаваў ген чалавечага EPO, а затым рэалізаваў вытворчасць сінтэтычнага EPO з дапамогай тэхналогіі рэкамбінацыі ДНК.

Рэкамбінантны EPO чалавека мае тую ж паслядоўнасць, што і бялок эндагеннага EPO, а таксама аналагічную мадыфікацыю гліказілявання. Натуральна, рэкамбінантныя ЭПО чалавека таксама валодае актыўнасцю эндагеннага ЭПО. У чэрвені 1989 года першы прадукт Amgen, рэкамбінантны чалавечы эрытрапаэтын Epogen, быў ухвалены FDA ЗША для лячэння анеміі, выкліканай хранічнай нырачнай недастатковасцю, і анеміі пры лячэнні ВІЧ-інфекцыі. Продажы Epogen перавысілі 16 мільёнаў долараў усяго за тры месяцы. На працягу наступных двух дзесяцігоддзяў Amgen дамінавала на рынку паўторна сабраных чалавечых EPO. Толькі ў 2010 годзе Epogen прынёс Amgen 2,5 мільярда долараў даходу. У 2018 годзе фондавы кошт Amgen склаў 128,8 мільярда долараў, што робіць яе восьмай па велічыні фармацэўтычнай кампаніяй у свеце.

Варта адзначыць, што Amgen першапачаткова працаваў з Goldwasser, каб забяспечыць вычышчаныя бялкі EPO чалавека для секвенирования, але Goldwasser і Amgen неўзабаве разышліся з-за ідэалагічных рознагалоссяў. Голдвасер і яго Чыкагскі ўніверсітэт, якія праводзілі фундаментальныя даследаванні, ніколі не думалі запатэнтаваць адкрыты ім гармон, і таму не атрымалі ні капейкі за вялікі камерцыйны поспех EPO.

Гэта - наколькі гэта стымулятар

Калі мы дыхаем, кісларод трапляе ў мітахондрыі клетак, каб кіраваць дыхальнай ланцугом і вырабляць велізарную колькасць АТФ, асноўнай крыніцы энергіі ў нашым целе. У людзей з анеміяй недастаткова здаровых чырвоных крывяных цельцаў, і самым непасрэдным эфектам з'яўляецца тое, што яны не прымаюць дастатковую колькасць кіслароду, што прымушае іх адчуваць сябе стомленымі, падобнымі на праблемы з дыханнем падчас доўгай прабежкі. Пры ін'екцыі рэкамбінантнага чалавечага ЭПО арганізм пацыентаў з анеміяй выпрацоўвае больш эрытрацытаў,пераносіць больш кіслароду і выпрацоўваць больш энергетычнай малекулы АТФ, эфектыўна палягчаючы сімптомы.

Аднак некаторыя спартыўныя работнікі таксама пачалі думаць пра рэкамбінантны чалавечы EPO. Калі штучны рэкамбінантны гармон тыпу EPO выкарыстоўваецца для стымуляцыі арганізма спартсменаў выпрацоўваць больш эрытрацытаў, можна палепшыць здольнасць спартсменаў атрымліваць кісларод і выпрацоўваць малекулы энергіі, што таксама можа палепшыць вынікі спартсменаў у цягавітасці такія мерапрыемствы, як веласіпедныя гонкі, бег на доўгія дыстанцыі і лыжныя гонкі. Дакумент 1980 года ў Journal of Applied Physiology паказаў, што стымулятары крыві (эрытрапаэтын, штучныя пераносчыкі кіслароду і пераліванне крыві) могуць павялічыць цягавітасць на 34 працэнты. Калі спартсмены выкарыстоўваюць EPO, яны могуць прабегчы 8 кіламетраў на бегавой дарожцы за 44 секунды меншы час, чым раней. Фактычна, язда на ровары і марафоны былі найгоршымі парушальнікамі для стымулятараў EPO. Падчас Тур дэ Франс 1998 г. доктар іспанскай каманды Festina быў арыштаваны на французскай мяжы з 400 бутэлькамі штучнага рэкамбінантнага EPO! У выніку, вядома, усю каманду выключылі з Тура і забанілі.

Міжнародны алімпійскі камітэт дадаў EPO ў свой спіс забароненых на Гульнях у Барселоне ў 1992 годзе, але рэарганізаваць тэсціраванне EPO на людзях было настолькі складана, што да Гульняў 2000 года не было магчымасці эфектыўна выявіць, ці выкарыстоўваюць яго спартсмены. Ёсць некалькі прычын: 1) утрыманне ЭПО ў вадкасцях арганізма вельмі нізкае, і ЭПО на мл крыві ў нармальных людзей складае каля 130-230 нанаграм; 2) Амінакіслотны склад штучнага рэкамбінантнага EPO сапраўды такі ж, як і ў чалавечага эндагеннага бялку EPO, толькі форма гліказілявання вельмі нязначна адрозніваецца; 3) Перыяд паўраспаду EPO ў крыві складае ўсяго 5-6 гадзін, і ён звычайна не выяўляецца праз 4-7 дзён пасля апошняй ін'екцыі; 4) Індывідуальны ўзровень EPO вельмі розны, таму цяжка ўсталяваць абсалютны колькасны стандарт.

З 2000 года WADA выкарыстоўвае аналіз мачы ў якасці адзінага навуковага метаду праверкі прамога выяўлення рэкамбінантнага ЭПО. З-за невялікіх адрозненняў паміж глікаілаванай формай штучнага рэкамбінантнага EPO і чалавечага EPO зараджаныя ўласцівасці дзвюх малекул вельмі малыя, і іх можна адрозніць метадам электрафарэзу, званым ізаэлектрычным факусаваннем, які з'яўляецца асноўнай стратэгіяй для прамое выяўленне штучнага рэкамбінантныя ЭПО. Аднак некаторыя рэкамбінантныя ЭПВ, экспрэсіраваныя клеткамі чалавека, не паказалі розніцы ў гліказіляванні, таму некаторыя эксперты выказалі здагадку, што экзагенны ЭПВ і эндагенны ЭПВ павінны адрознівацца розным утрыманнем ізатопаў вугляроду.

Фактычна існуюць абмежаванні ў розных метадах тэставання EPO. Напрыклад, Лэнс Армстранг, легенда амерыканскага веласіпеднага спорту, прызнаўся, што прымаў EPO і іншыя стымулятары падчас сваіх сямі перамог на "Тур дэ Франс", але на той момант ніводная допінг-проба не пацвердзіла станоўчага выніку на EPO. Нам яшчэ трэба пачакаць і паглядзець, «на адну нагу вышэй» ці на «нагу вышэй».

Як атрымліваецца Нобелеўская прэмія

Апошняе слова пра сувязь паміж EPO і Нобелеўскай прэміяй па фізіялогіі і медыцыне 2019 года.

ЭПО - найбольш тыповы выпадак успрымання і рэакцыі арганізма чалавека на гіпаксію. Таму Семенца і Рэткліф, два нобелеўскія лаўрэаты, абралі EPO ў якасці адпраўной кропкі для вывучэння механізму ўспрымання клетак і адаптацыі да гіпаксіі. Першым крокам было знайсці элементы гена EPO, якія маглі б рэагаваць на змены кіслароду. Semenza ідэнтыфікаваў ключавую некадуючую паслядоўнасць з 256 падстаў на 3'-ніжнім канцы гена, які кадуе EPO, названую элементам адказу на гіпаксію. Калі гэтая паслядоўнасць элемента мутавана або выдалена, здольнасць бялку EPO рэагаваць на гіпаксію значна зніжаецца. Калі гэтая паслядоўнасць элемента зліта з 3'-канцом ніжэй па плыні іншых генаў, не звязаных з гіпаксіяй, гэтыя мадыфікаваныя гены таксама дэманструюць EPO-падобную актывацыюва ўмовах гіпаксіі.

Затым Рэткліф і яго каманда выявілі, што гэты элемент рэакцыі на гіпаксію прысутнічае не толькі ў клетках нырак і печані, адказных за выпрацоўку ЭПО, але і ў многіх іншых тыпах клетак, якія могуць функцыянаваць ва ўмовах гіпаксіі. Іншымі словамі, гэтая рэакцыя на гіпаксію можа быць не спецыфічнай для EPO, а больш шырока распаўсюджанай з'явай у клетках. Гэтыя іншыя клеткі, якія не адказваюць за выпрацоўку EPO, павінны ўтрымліваць малекулы (напрыклад, фактары транскрыпцыі, адказныя за ўключэнне экспрэсіі генаў), якія адчуваюць змены ў канцэнтрацыі кіслароду і звязваюцца з элементамі рэагавання на гіпаксію, каб уключыць такія гены, як EPO.