Tri dobitnika Nobelove nagrade za fiziologiju ili medicinu 2019., William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza i Sir Peter J. Ratcliffe, već su osvojili Laskerovu nagradu za osnovnu medicinu 2016. za svoj rad na tome kako ćelije osjećaju i prilagođavaju se do hipoksije, tako da to nije bilo posebno iznenađujuće. Oni su otkrili i identifikovali ključni molekul faktor 1 koji izaziva hipoksiju (HIF-1). Danas se želimo vratiti porijeklu studije, a to je eritropoetin, ili EPO, čudotvorni molekul.

To je najvažniji faktor u proizvodnji crvenih krvnih zrnaca

Crvena krvna zrnca su najzastupljenija vrsta krvnih stanica u krvi i glavni su medij za transport kisika i ugljičnog dioksida kroz krv kralježnjaka. Eritrociti se stvaraju u koštanoj srži: hematopoetske matične stanice prvo se razmnožavaju i diferenciraju u progenitore različitih krvnih stanica, a eritroidni progenitori se mogu dalje diferencirati i sazreti u eritrocite. U normalnim uvjetima, stopa proizvodnje eritrocita kod ljudi je vrlo niska, ali pod stresom kao što su krvarenje, hemoliza i hipoksija, stopa proizvodnje eritrocita može se povećati i do osam puta. U ovom procesu, eritropoetin EPO je jedan od najvažnijih faktora.

EPO je hormon koji se sintetizira uglavnom u bubrezima. Njegova hemijska priroda je visoko glikoziliran protein. Zašto u bubrezima? Svakog minuta kroz bubrege protiče oko litar krvi, tako da oni mogu brzo i efikasno otkriti promjene nivoa kiseonika u krvi. Kada je nivo kiseonika u krvi nizak, bubrezi brzo reaguju i proizvode velike količine EPO. Potonji cirkulira kroz krvotok do koštane srži, gdje potiče pretvaranje eritroidnih progenitornih stanica u crvena krvna zrnca. Zrela crvena krvna zrnca se oslobađaju iz koštane srži u cirkulatorni sistem kako bi se poboljšala sposobnost tijela da se veže za kisik. Kada bubrezi osete povećanje kiseonika u krvi, oni smanjuju proizvodnju EPO, što zauzvrat smanjuje količinu crvenih krvnih zrnaca u koštanoj srži.

Ovo čini savršenu petlju za podešavanje. Međutim, ljudi koji žive na velikoj nadmorskoj visini i neki pacijenti sa anemijom često se susreću sa stanjem kontinuirano niskog nivoa kiseonika u krvi, koji ne može da dovrši gornju cirkulaciju i stimuliše bubrege da kontinuirano luče EPO, tako da je koncentracija EPO u krvi veća od običnih ljudi.

Bilo je potrebno skoro 80 godina da se to otkrije

Kao i mnoga velika otkrića, razumijevanje EPO-a od strane naučnika nije bilo glatko, s pitanjima i izazovima na tom putu. Bilo je potrebno skoro 80 godina od koncepta EPO do konačnog određivanja specifičnog molekula.

Godine 1906. francuski naučnici Carnot i Deflandre ubrizgali su normalnim zečevima serum anemičnih zečeva i otkrili da se povećao broj crvenih krvnih zrnaca u plazmi normalnih zečeva. Vjerovali su da neki humoralni faktori u plazmi mogu stimulirati i regulirati proizvodnju crvenih krvnih zrnaca. Ovo je bio prvi EPO prototip koncepta. Nažalost, rezultati se nisu ponovili u narednim decenijama, uglavnom zato što broj novih crvenih krvnih zrnaca nije bio tačan.

Reissmann i Ruhenstroth-Bauerov eksperiment parabioze iz 1950. pružio je zaista jake dokaze. Oni su hirurškim putem povezali krvožilni sistem dva živa štakora, stavljajući jednog u hipoksičnu sredinu, a drugog da diše normalan vazduh. Kao rezultat toga, oba miša su proizvela ogromne količine crvenih krvnih zrnaca. Nema sumnje da u krvotoku postoji hormon koji stimuliše proizvodnju crvenih krvnih zrnaca, po čemu je EPO i dobio ime. S druge strane, EPO je vrlo osjetljiv na hipoksiju.

Koji je molekul EPO? Američkom naučniku Goldwasseru je trebalo 30 godina da konačno razjasni problem na biohemijskom nivou. Ako radnik želi da obavi dobar posao, prvo mora da naoštri svoj alat. Funkcija EPO je da stimuliše nova crvena krvna zrnca, alibroj ovih potonjih nije tačan. Najvažnija funkcionalna molekula u crvenim krvnim zrncima je hemoglobin koji sadrži hem, koji sadrži ion željeza u svom središtu. Tako je Goldwasserov tim označio novorođena crvena krvna zrnca radioaktivnim izotopima željeza i razvio osjetljivu metodu za otkrivanje aktivnosti EPO. Ovo omogućava izolaciju i prečišćavanje vrlo niskih koncentracija EPO (nanograma po mililitru) iz uzoraka životinjskih tekućina. Ali izolacija EPO-a bila je izuzetno teška. Prešli su s bubrežne na anemijsku ovčju plazmu, na urin pacijenata s teškim nedostatkom gvožđa zbog infekcije ankilostomi, i konačno, 1977. godine, prečistili su 8 miligrama humanog EPO proteina iz 2.550 litara urina japanskih pacijenata sa aplastičnom anemijom.

Godine 1985. završeno je sekvenciranje proteina i kloniranje gena ljudskog EPO. EPO gen kodira polipeptid sa 193 amino ostatka, koji postaje zreli protein sastavljen od 166 aminokiselinskih ostataka nakon što je signalni peptid odrezan tokom sekrecije, i sadrži 4 mjesta za modifikaciju glikozilacije. Godine 1998. analizirana je struktura NMR rastvora EPO i kristalna struktura EPO i njegovog receptorskog kompleksa. U ovom trenutku ljudi imaju najintuitivnije razumijevanje EPO.

Do sada je liječenje anemije obično zahtijevalo transfuziju krvi kako bi se nadoknadio nedostatak crvenih krvnih zrnaca. Kako ljudi saznaju više o EPO-u, njegovo ubrizgavanje kako bi se stimulirala proizvodnja crvenih krvnih zrnaca u vlastitoj koštanoj srži je olakšalo problem. Ali prečišćavanje EPO-a direktno iz tjelesnih tekućina, kao što je to učinio Goldwasser, je teško i prinosi su mali. Određivanje EPO proteina i sekvence gena omogućilo je proizvodnju rekombinantnog humanog EPO u velikim količinama.

To je uradila biotehnološka kompanija pod nazivom Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen je osnovan 1980. godine sa samo sedam članova, nadajući se da će proizvoditi biofarmaceutike pomoću tehnika molekularne biologije koje su tada bile u nastajanju. Interferon, faktor oslobađanja hormona rasta, vakcina protiv hepatitisa B, epidermalni faktor rasta bili su među vrućim imenima na njihovoj listi meta, ali nijedan od ovih pokušaja nije uspio. Do 1985. godine, Lin Fukun, kineski naučnik iz Tajvana, Kina, klonirao je gen ljudskog EPO, a zatim realizovao proizvodnju sintetičkog EPO koristeći tehnologiju rekombinacije DNK.

Rekombinantni humani EPO ima istu sekvencu kao endogeni EPO protein, a također ima sličnu modifikaciju glikozilacije. Naravno, rekombinantni ljudski EPO takođe ima aktivnost endogenog EPO. U junu 1989. godine, prvi Amgenov proizvod, rekombinantni humani eritropoetin Epogen, odobren je od strane američke FDA za liječenje anemije uzrokovane kroničnim zatajenjem bubrega i anemije u liječenju HIV infekcije. Prodaja Epogena premašila je 16 miliona dolara za samo tri mjeseca. Tokom naredne dve decenije, Amgen je dominirao tržištem ponovo sastavljenih ljudskih EPO. Epogen je samo u 2010. godini donio Amgenu 2,5 milijardi dolara prihoda. U 2018. tržišna vrijednost Amgena bila je 128,8 milijardi dolara, što ga čini osmom po veličini farmaceutskom kompanijom na svijetu.

Vrijedi napomenuti da je Amgen u početku radio s Goldwasserom na obezbjeđivanju pročišćenih ljudskih EPO proteina za sekvenciranje, ali su Goldwasser i Amgen ubrzo pali zbog ideoloških razlika. Goldwasser i njegov Univerzitet u Čikagu, koji su radili osnovna istraživanja, nikada nisu pomislili da patentiraju hormon koji je otkrio, pa nisu dobili ni peni za ogroman komercijalni uspjeh EPO-a.

Kako je to stimulans

Kada dišemo, kisik ulazi u mitohondrije stanica da pokreće respiratorni lanac i proizvodi ogromne količine ATP-a, glavnog izvora energije u našim tijelima. Anemični ljudi nemaju dovoljno zdravih crvenih krvnih zrnaca, a najneposredniji efekat je da ne unose dovoljno kiseonika, zbog čega se osećaju umorno, slično problemima sa disanjem tokom dužeg trčanja. Kada se ubrizgava rekombinantni ljudski EPO, tijela pacijenata sa anemijom proizvode više crvenih krvnih zrnaca,nose više kiseonika i proizvode više molekula energije ATP, efikasno ublažavajući simptome.

Međutim, neki sportski radnici su također počeli razmišljati o rekombinantnom ljudskom EPO. Ako se veštački rekombinantni hormon tipa EPO koristi da stimuliše telo sportista da proizvodi više crvenih krvnih zrnaca, moguće je poboljšati sposobnost sportista da dobiju kiseonik i proizvode molekule energije, što takođe može poboljšati performanse sportista u izdržljivosti. događaji kao što su biciklizam, trčanje na duge staze i skijaško trčanje. Rad iz 1980. u Journal of Applied Physiology pokazao je da stimulansi krvi (eritropoetin, umjetni nosači kisika i transfuzije krvi) mogu povećati izdržljivost za 34 posto. Ako sportisti koriste EPO, mogu trčati 8 kilometara na traci za trčanje za 44 sekunde kraće nego prije. U stvari, biciklizam i maraton su bili najgori prekršaj za EPO stimulanse. Tokom Tur de Fransa 1998., španski timski lekar za tim Festina je uhapšen na francuskoj granici sa 400 boca veštačkog rekombinantnog EPO! Rezultat je, naravno, bio da je cijeli tim izbačen sa Toura i zabranjen.

Međunarodni olimpijski komitet dodao je EPO na svoju zabranjenu listu na Igrama u Barseloni 1992., ali reorganizacija testiranja EPO kod ljudi bila je toliko teška da prije Igara 2000. nije bilo načina da se efikasno otkrije da li ga sportisti koriste. Postoji nekoliko razloga: 1) Sadržaj EPO u tjelesnim tečnostima je veoma nizak, a EPO po ml krvi kod normalnih ljudi iznosi oko 130-230 nanograma; 2) Sastav aminokiselina vještačkog rekombinantnog EPO je potpuno isti kao i humanog endogenog EPO proteina, samo se oblik glikozilacije vrlo malo razlikuje; 3) Poluvrijeme EPO u krvi je samo 5-6 sati, a općenito se ne može detektirati 4-7 dana nakon posljednje injekcije; 4) Pojedinačni nivo EPO je veoma različit, tako da je teško uspostaviti apsolutni kvantitativni standard.

Od 2000. godine WADA koristi testiranje urina kao jedinu naučnu metodu verifikacije za direktnu detekciju rekombinantnog EPO. Zbog malih razlika između glikoiliranog oblika umjetnog rekombinantnog EPO-a i ljudskog EPO-a, svojstva naelektrisanja dvaju molekula su vrlo mala i mogu se razlikovati metodom elektroforeze koja se naziva izoelektrično fokusiranje, što je glavna strategija za direktna detekcija vještačkog rekombinantnog EPO. Međutim, neki rekombinantni EPO eksprimirani u ljudskim ćelijama nisu pokazali nikakvu razliku u glikozilaciji, pa su neki stručnjaci sugerirali da se egzogeni EPO i endogeni EPO razlikuju po različitom sadržaju izotopa ugljika.

U stvari, još uvijek postoje ograničenja u različitim metodama testiranja za EPO. Na primjer, Lance Armstrong, američka biciklistička legenda, priznao je da je uzimao EPO i druge stimulanse tokom svojih sedam pobjeda na Tour de Franceu, ali zapravo nije bio pozitivan na EPO ni na jednom doping testu u to vrijeme. Ostaje nam još da sačekamo da vidimo da li je "jedna stopa više" ili "jedna stopa više".

Kako to donosi Nobelovu nagradu

Posljednja riječ o povezanosti EPO-a i Nobelove nagrade za fiziologiju i medicinu 2019.

EPO je najtipičniji slučaj percepcije i odgovora ljudskog organizma na hipoksiju. Stoga su Semenza i Ratcliffe, dva nobelovca, odabrali EPO kao polaznu tačku za proučavanje mehanizma percepcije stanica i adaptacije na hipoksiju. Prvi korak je bio pronalaženje elemenata EPO gena koji bi mogli odgovoriti na promjene kisika. Semenza je identifikovao ključnu nekodirajuću sekvencu od 256 baza na 3' nizvodnom kraju gena koji kodira EPO, nazvan element odgovora na hipoksiju. Ako je ova sekvenca elementa mutirana ili izbrisana, sposobnost EPO proteina da odgovori na hipoksiju je znatno smanjena. Ako je ova sekvenca elemenata spojena sa nizvodnim 3' krajem drugih gena koji nisu povezani s hipoksijom, ovi modificirani geni također pokazuju aktivaciju sličnu EPOu uslovima hipoksije.

Ratcliffe i njegov tim su tada otkrili da ovaj element hipoksičnog odgovora nije prisutan samo u stanicama bubrega ili jetre odgovornim za proizvodnju EPO, već i u mnogim drugim tipovima stanica koje mogu funkcionirati u hipoksičnim uvjetima. Drugim riječima, ovaj odgovor na hipoksiju možda nije specifičan za EPO, već je rašireniji fenomen u stanicama. Ove druge ćelije, koje nisu odgovorne za proizvodnju EPO, moraju sadržavati molekule (kao što su faktori transkripcije odgovorni za uključivanje ekspresije gena) koji osjećaju promjene u koncentraciji kisika i vezuju se za elemente hipoksičnog odgovora kako bi uključili gene kao što je EPO.