Tři vítězové Nobelovy ceny za fyziologii a medicínu za rok 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza a Sir Peter J. Ratcliffe již získali Laskerovu cenu za základní medicínu za rok 2016 za svou práci o tom, jak buňky vnímají a přizpůsobují se. k hypoxii, takže to nebylo nijak zvlášť překvapivé. Objevili a identifikovali klíčovou molekulu hypoxií indukovatelný faktor 1 (HIF-1). Dnes se chceme vrátit ke vzniku studie, kterou je erytropoetin neboli EPO, zázračná molekula.

Je to nejdůležitější faktor při tvorbě červených krvinek

Červené krvinky jsou nejhojnějším typem krvinek v krvi a jsou hlavním médiem pro transport kyslíku a oxidu uhličitého krví obratlovců. Erytrocyty jsou generovány v kostní dřeni: Hematopoetické kmenové buňky nejprve proliferují a diferencují se na progenitory různých krevních buněk a erytroidní progenitory se mohou dále diferencovat a zrát na erytrocyty. Za normálních podmínek je produkce lidských erytrocytů velmi nízká, ale při stresu, jako je krvácení, hemolýza a hypoxie, může být rychlost produkce erytrocytů zvýšena až osmkrát. V tomto procesu je jedním z nejdůležitějších faktorů erytropoetin EPO.

EPO je hormon syntetizovaný hlavně v ledvinách. Jeho chemická povaha je vysoce glykosylovaný protein. Proč v ledvinách? Ledvinami proteče každou minutu asi litr krve, takže dokážou rychle a efektivně detekovat změny hladiny kyslíku v krvi. Když je hladina kyslíku v krvi nízká, ledviny reagují rychle a produkují velké množství EPO. Ten cirkuluje krevním řečištěm do kostní dřeně, kde podporuje přeměnu erytroidních progenitorových buněk na červené krvinky. Zralé červené krvinky se uvolňují z kostní dřeně do oběhového systému, aby se zlepšila schopnost těla vázat se na kyslík. Když ledviny zaznamenají zvýšení kyslíku v krvi, sníží produkci EPO, což zase sníží množství červených krvinek v kostní dřeni.

To vytváří dokonalou smyčku nastavení. Lidé žijící ve vysokých nadmořských výškách a někteří pacienti s anémií se však často setkávají se stavem trvale nízké hladiny kyslíku v krvi, která nemůže dokončit výše uvedený oběh a stimulovat ledviny k trvalé sekreci EPO, takže koncentrace EPO v krvi je vyšší než u běžných lidí.

Odhalení trvalo téměř 80 let

Stejně jako mnoho velkých objevů, ani pochopení EPO vědci neprobíhalo hladce, s otázkami a výzvami. Od konceptu EPO ke konečnému stanovení specifické molekuly uběhlo téměř 80 let.

V roce 1906 francouzští vědci Carnot a Deflandre vstříkli normálním králíkům sérum anemických králíků a zjistili, že počet červených krvinek v plazmě normálních králíků se zvýšil. Věřili, že některé humorální faktory v plazmě mohou stimulovat a regulovat produkci červených krvinek. Jednalo se o první prototyp konceptu EPO. Bohužel, výsledky nebyly replikovány v následujících desetiletích, hlavně proto, že počet nových červených krvinek nebyl přesný.

Reissmannův a Ruhenstroth-Bauerův experiment s parabiózou v roce 1950 přinesl opravdu pádné důkazy. Chirurgicky propojili oběhový systém dvou žijících krys, jednu umístili do hypoxického prostředí a druhou dýchali normální vzduch. Výsledkem bylo, že obě myši produkovaly obrovské množství červených krvinek. Není pochyb o tom, že v krevním řečišti existuje hormon, který stimuluje tvorbu červených krvinek, podle čehož má EPO svůj název. Na druhou stranu je EPO velmi citlivý na hypoxii.

Jaká molekula je EPO? Americkému vědci Goldwasserovi trvalo 30 let, než konečně objasnil problém na biochemické úrovni. Pokud chce dělník odvádět dobrou práci, musí si nejprve nabrousit nástroje. Funkcí EPO je stimulovat nové červené krvinky, alepočet posledně jmenovaných není přesný. Nejdůležitější funkční molekulou v červených krvinkách je hemoglobin obsahující hem, který ve svém středu obsahuje železnatý iont. Goldwasserův tým tedy označil novorozené červené krvinky radioaktivními izotopy železa a vyvinul citlivou metodu pro detekci aktivity EPO. To umožňuje izolovat a čistit velmi nízké koncentrace EPO (nanogramy na mililitr) ze vzorků zvířecích tekutin. Ale izolace EPO byla extrémně obtížná. Přešli z ledvin na anemickou ovčí plazmu, na moč pacientů s těžkým nedostatkem železa v důsledku infekce měchovcem a nakonec v roce 1977 vyčistili 8 miligramů lidského proteinu EPO z 2550 litrů moči japonských pacientů s aplastickou anémií.

V roce 1985 bylo dokončeno sekvenování proteinů a genové klonování lidského EPO. EPO gen kóduje polypeptid se 193 aminokyselinovými zbytky, který se po odstřižení signálního peptidu během sekrece stává zralým proteinem složeným ze 166 aminokyselinových zbytků a obsahuje 4 místa pro glykosylační modifikaci. V roce 1998 byla analyzována struktura roztoku EPO NMR a krystalická struktura EPO a jeho receptorového komplexu. V tomto okamžiku lidé nejvíce intuitivně chápou EPO.

Až dosud vyžadovala léčba anémie obvykle krevní transfuze, aby se doplnil nedostatek červených krvinek. Jak se lidé dozvídají více o EPO, jeho injekční podávání ke stimulaci tvorby červených krvinek v jejich vlastní kostní dřeni tento problém zjednodušilo. Ale čištění EPO přímo z tělesných tekutin, jak to dělal Goldwasser, je obtížné a výtěžky jsou nízké. Stanovení proteinu a genové sekvence EPO umožnilo produkovat rekombinantní lidský EPO ve velkých množstvích.

Bylo to provedeno biotechnologickou společností s názvem Applied Molecular Genetics (Amgen). Společnost Amgen byla založena v roce 1980 s pouhými sedmi členy v naději, že bude vyrábět biofarmaceutika pomocí tehdy se objevujících technik molekulární biologie. Interferon, faktor uvolňující růstový hormon, vakcína proti hepatitidě B, epidermální růstový faktor patřily mezi žhavá jména na jejich seznamu cílů, ale žádný z těchto pokusů nebyl úspěšný. Do roku 1985 Lin Fukun, čínský vědec z Tchaj-wanu v Číně, klonoval gen lidského EPO a poté realizoval výrobu syntetického EPO pomocí technologie rekombinace DNA.

Rekombinantní lidský EPO má stejnou sekvenci jako endogenní protein EPO a má také podobnou glykosylační modifikaci. Rekombinantní lidský EPO má přirozeně také aktivitu endogenního EPO. V červnu 1989 byl první produkt společnosti Amgen, rekombinantní lidský erytropoetin Epogen, schválen americkou FDA pro léčbu anémie způsobené chronickým selháním ledvin a anémie při léčbě infekce HIV. Tržby Epogenu přesáhly 16 milionů dolarů za pouhé tři měsíce. Během následujících dvou dekád společnost Amgen dominovala trhu se znovu sestaveným lidským EPO. Epogen jen v roce 2010 přinesl společnosti Amgen příjmy ve výši 2,5 miliardy dolarů. V roce 2018 byla hodnota Amgenu na akciovém trhu 128,8 miliardy dolarů, což z něj činí osmou největší farmaceutickou společnost na světě.

Stojí za zmínku, že Amgen zpočátku spolupracoval s Goldwasserem, aby poskytl purifikované lidské EPO proteiny pro sekvenování, ale Goldwasser a Amgen se brzy rozešli kvůli ideologickým rozdílům. Goldwasser a jeho University of Chicago, která prováděla základní výzkum, nikdy nenapadlo patentovat hormon, který objevil, a tak za obrovský komerční úspěch EPO nedostali ani korunu.

To -- jak je to stimulant

Když dýcháme, kyslík vstupuje do mitochondrií buněk, aby poháněl dýchací řetězec a produkoval obrovské množství ATP, hlavního zdroje energie v našem těle. Chudokrevní lidé nemají dostatek zdravých červených krvinek a nejokamžitějším efektem je, že nepřijímají dostatek kyslíku, díky čemuž se cítí unavení, podobně jako při potížích s dýcháním při dlouhém běhu. Při injekci rekombinantního lidského EPO produkují těla pacientů s anémií více červených krvinek,přenášejí více kyslíku a produkují více energetické molekuly ATP, čímž účinně zmírňují příznaky.

Někteří sportovní pracovníci však také začali uvažovat o rekombinantním lidském EPO. Pokud se použije umělý rekombinantní hormon typu EPO ke stimulaci organismu sportovců k produkci většího množství červených krvinek, je možné zlepšit schopnost sportovců získávat kyslík a produkovat molekuly energie, což může zlepšit i výkonnost sportovců ve vytrvalosti. akce jako cyklistika, běh na dlouhé tratě a běh na lyžích. Článek z roku 1980 v Journal of Applied Physiology ukázal, že stimulanty krve (erytropoetin, umělé přenašeče kyslíku a krevní transfuze) mohou zvýšit vytrvalost o 34 procent. Pokud sportovci používají EPO, mohou uběhnout 8 kilometrů na běžeckém pásu za 44 sekund kratší dobu než dříve. Cyklistika a maratony byly ve skutečnosti nejhoršími pachateli stimulantů EPO. Během Tour de France v roce 1998 byl na francouzských hranicích zatčen lékař španělského týmu Festina se 400 lahvemi umělého rekombinantního EPO! Výsledkem samozřejmě bylo, že celý tým byl vyhozen z Tour a zakázán.

Mezinárodní olympijský výbor přidal EPO na svůj zakázaný seznam na hrách v Barceloně v roce 1992, ale reorganizace testování lidského EPO byla tak obtížná, že před hrami v roce 2000 neexistoval způsob, jak účinně zjistit, zda jej sportovci používají. Důvodů je několik: 1) Obsah EPO v tělesných tekutinách je velmi nízký a EPO na ml krve u normálních lidí je asi 130-230 nanogramů; 2) Aminokyselinové složení umělého rekombinantního EPO je přesně stejné jako složení lidského endogenního EPO proteinu, pouze forma glykosylace je velmi mírně odlišná; 3) Poločas rozpadu EPO v krvi je pouze 5-6 hodin a obecně je nedetekovatelný 4-7 dní po poslední injekci; 4) Jednotlivé úrovně EPO jsou velmi odlišné, takže je obtížné stanovit absolutní kvantitativní standard.

Od roku 2000 WADA používá testování moči jako jedinou vědeckou ověřovací metodu pro přímou detekci rekombinantního EPO. Vzhledem k nepatrným rozdílům mezi glykoylovanou formou umělého rekombinantního EPO a lidského EPO jsou nabité vlastnosti těchto dvou molekul velmi malé a lze je odlišit elektroforézou zvanou izoelektrická fokusace, která je hlavní strategií pro přímou detekci umělého rekombinantního EPO. Některé rekombinantní EPO exprimované buňkami odvozenými od člověka však nevykazovaly žádný rozdíl v glykosylaci, takže někteří odborníci navrhli, že exogenní EPO a endogenní EPO by se měly odlišovat různým obsahem izotopů uhlíku.

Ve skutečnosti stále existují omezení v různých testovacích metodách pro EPO. Například Lance Armstrong, americká cyklistická legenda, přiznal, že bral EPO a další stimulanty během svých sedmi vítězství na Tour de France, ale ve skutečnosti nebyl v té době potvrzen pozitivní na EPO v žádném dopingovém testu. Musíme ještě počkat, zda je "o stopu výš" nebo "o stopu výš".

Jak to dělá Nobelovu cenu

Poslední slovo o spojení mezi EPO a Nobelovou cenou za fyziologii a medicínu za rok 2019.

EPO je nejtypičtějším případem vnímání a reakce lidského těla na hypoxii. Proto Semenza a Ratcliffe, dva laureáti Nobelovy ceny, zvolili EPO jako výchozí bod pro studium mechanismu buněčného vnímání a adaptace na hypoxii. Prvním krokem bylo nalezení prvků genu EPO, které by mohly reagovat na změny kyslíku. Semenza identifikovala klíčovou nekódující sekvenci o 256 bázích na 3' konci genu kódujícího EPO po směru transkripce, nazvanou prvek odezvy na hypoxii. Pokud je tato sekvence elementu mutována nebo deletována, schopnost EPO proteinu reagovat na hypoxii je značně snížena. Pokud je tato elementární sekvence fúzována s downstream 3' koncem jiných genů, které nejsou spojeny s hypoxií, tyto modifikované geny také vykazují aktivaci podobnou EPOza podmínek hypoxie.

Ratcliffe a jeho tým poté zjistili, že tento prvek hypoxické odezvy není přítomen pouze v ledvinách nebo jaterních buňkách odpovědných za produkci EPO, ale také v mnoha dalších typech buněk, které mohou fungovat za hypoxických podmínek. Jinými slovy, tato reakce na hypoxii nemusí být specifická pro EPO, ale spíše rozšířenější jev v buňkách. Tyto další buňky, které nejsou zodpovědné za produkci EPO, musí obsahovat molekuly (jako jsou transkripční faktory odpovědné za zapnutí genové exprese), které snímají změny koncentrace kyslíku a vážou se na prvky hypoxické odezvy, aby aktivovaly geny, jako je EPO.