Roedd tri enillydd Gwobr Nobel 2019 mewn Ffisioleg neu Feddygaeth, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza a Syr Peter J. Ratcliffe eisoes wedi ennill Gwobr Lasker 2016 mewn Meddygaeth Sylfaenol am eu gwaith ar sut mae celloedd yn synhwyro ac yn addasu i hypocsia, felly nid oedd yn syndod mawr. Fe wnaethon nhw ddarganfod a nodi'r moleciwl allweddol ffactor hypocsia-anwythadwy 1 (HIF-1). Heddiw rydym am fynd yn ôl at darddiad yr astudiaeth, sef erythropoietin, neu EPO, moleciwl gwyrthiol.

Dyma'r ffactor pwysicaf mewn cynhyrchu celloedd gwaed coch

Celloedd coch y gwaed yw'r math mwyaf helaeth o gelloedd gwaed yn y gwaed, a dyma'r prif gyfrwng ar gyfer cludo ocsigen a charbon deuocsid trwy waed fertebratau. Mae erythrocytes yn cael eu cynhyrchu ym mêr yr esgyrn: mae bôn-gelloedd hematopoietig yn amlhau ac yn gwahaniaethu i epilyddion celloedd gwaed amrywiol, a gall epilyddion erythroid wahaniaethu ac aeddfedu ymhellach yn erythrocytes. O dan amodau arferol, mae cyfradd cynhyrchu erythrocyte dynol yn isel iawn, ond o dan straen fel gwaedu, hemolysis, a hypocsia, gellir cynyddu cyfradd cynhyrchu erythrocyte hyd at wyth gwaith. Yn y broses hon, erythropoietin EPO yw un o'r ffactorau pwysicaf.

Mae EPO yn hormon wedi'i syntheseiddio yn bennaf yn yr aren. Mae ei natur gemegol yn brotein hynod glycosylaidd. Pam yn yr arennau? Mae tua litr o waed yn llifo trwy'r arennau bob munud, fel y gallant ganfod newidiadau yn lefelau ocsigen yn y gwaed yn gyflym ac yn effeithlon. Pan fydd lefelau ocsigen yn y gwaed yn isel, mae'r arennau'n ymateb yn gyflym ac yn cynhyrchu llawer iawn o EPO. Mae'r olaf yn cylchredeg trwy'r llif gwaed i'r mêr esgyrn, lle mae'n hyrwyddo trosi celloedd progenitor erythroid yn gelloedd gwaed coch. Mae celloedd gwaed coch aeddfed yn cael eu rhyddhau o'r mêr esgyrn i'r system gylchrediad gwaed er mwyn gwella gallu'r corff i rwymo i ocsigen. Pan fydd yr arennau'n synhwyro cynnydd mewn ocsigen yn y gwaed, maent yn lleihau cynhyrchiad EPO, sydd yn ei dro yn lleihau faint o gelloedd gwaed coch yn y mêr esgyrn.

Mae hyn yn gwneud dolen addasu berffaith. Fodd bynnag, mae pobl sy'n byw ar uchder uchel a rhai cleifion anemia yn aml yn dod ar draws cyflwr lefel ocsigen gwaed isel yn barhaus, na allant gwblhau'r cylchrediad uchod ac ysgogi'r aren i secrete EPO yn barhaus, fel bod y crynodiad EPO gwaed yn uwch na phobl gyffredin.

Cymerodd bron i 80 mlynedd i'w ddatgelu

Fel llawer o ddarganfyddiadau mawr, nid yw dealltwriaeth gwyddonwyr o EPO wedi bod yn hwylio llyfn, gyda chwestiynau a heriau ar hyd y ffordd. Cymerodd bron i 80 mlynedd o'r cysyniad o EPO i benderfyniad terfynol y moleciwl penodol.

Ym 1906, chwistrellodd y gwyddonwyr Ffrengig Carnot a Deflandre serwm cwningod anemig i gwningod normal a chanfod bod cyfrif celloedd coch y gwaed ym mhlasma cwningod arferol wedi cynyddu. Roeddent yn credu y gallai rhai ffactorau humoral yn y plasma ysgogi a rheoleiddio cynhyrchu celloedd gwaed coch. Hwn oedd y prototeip cysyniad EPO cyntaf. Yn anffodus, nid yw'r canlyniadau wedi'u hailadrodd yn y degawdau dilynol, yn bennaf oherwydd nad oedd cyfrif celloedd gwaed coch newydd yn gywir.

Darparodd arbrawf parabiosis Reissmann a Ruhenstroth-Bauer ym 1950 dystiolaeth gref iawn. Fe wnaethant gysylltu systemau cylchrediad gwaed dwy lygoden fawr yn llawfeddygol, gan osod un mewn amgylchedd hypocsig a'r llall yn anadlu aer normal. O ganlyniad, cynhyrchodd y ddau lygod lawer iawn o gelloedd gwaed coch. Nid oes amheuaeth bod hormon yn y llif gwaed sy'n ysgogi cynhyrchu celloedd gwaed coch, y mae EPO yn cael ei enw ohono. Ar y llaw arall, mae EPO yn sensitif iawn i hypocsia.

Pa foleciwl yw EPO? Cymerodd y gwyddonydd Americanaidd Goldwasser 30 mlynedd i egluro'r broblem o'r diwedd ar y lefel biocemegol. Os yw gweithiwr am wneud gwaith da, rhaid iddo hogi ei offer yn gyntaf. Swyddogaeth EPO yw ysgogi celloedd gwaed coch newydd, ondnid yw cyfrif yr olaf yn gywir. Y moleciwl swyddogaethol pwysicaf mewn celloedd gwaed coch yw haemoglobin sy'n cynnwys heme, sy'n cynnwys ïon fferrus yn ei ganol. Felly labelodd tîm Goldwasser gelloedd gwaed coch newydd-anedig ag isotopau haearn ymbelydrol a datblygodd ddull sensitif o ganfod gweithgaredd EPO. Mae hyn yn ei gwneud hi'n bosibl ynysu a phuro crynodiadau isel iawn o EPO (nanogramau fesul mililitr) o samplau hylif anifeiliaid. Ond roedd ynysu EPO yn hynod o anodd. Fe wnaethant newid o blasma arennau i ddefaid anemig, i wrin cleifion â diffyg haearn difrifol oherwydd haint llyngyr bach, ac yn olaf, ym 1977, purwyd 8 miligram o brotein EPO dynol o 2,550 litr o wrin gan gleifion Japaneaidd ag anemia aplastig.

Ym 1985, cwblhawyd y dilyniant protein a chlonio genynnau EPO dynol. Mae'r genyn EPO yn amgodio polypeptid â 193 o weddillion amino, sy'n dod yn brotein aeddfed sy'n cynnwys 166 o weddillion asid amino ar ôl i'r peptid signal gael ei glipio yn ystod secretiad, ac mae'n cynnwys 4 safle ar gyfer addasu glycosylation. Ym 1998, dadansoddwyd strwythur datrysiad NMR EPO a strwythur grisial EPO a'i gymhleth derbynnydd. Ar y pwynt hwn, mae gan bobl y ddealltwriaeth fwyaf greddfol o EPO.

Hyd yn hyn, roedd triniaeth ar gyfer anemia fel arfer yn gofyn am drallwysiadau gwaed i ailgyflenwi diffyg celloedd gwaed coch. Wrth i bobl ddysgu mwy am EPO, mae ei chwistrellu i ysgogi cynhyrchu celloedd gwaed coch yn eu mêr esgyrn eu hunain wedi gwneud y broblem yn haws. Ond mae puro EPO yn uniongyrchol o hylifau'r corff, fel y gwnaeth Goldwasser, yn anodd ac mae'r cynnyrch yn isel. Roedd pennu dilyniant protein a genynnau EPO yn ei gwneud hi'n bosibl cynhyrchu EPO dynol ailgyfunol mewn symiau mawr.

Fe'i gwnaed gan gwmni biotechnoleg o'r enw Applied Molecular Genetics (Amgen). Sefydlwyd Amgen yn 1980 gyda dim ond saith aelod, yn gobeithio gwneud biofferyllol gyda thechnegau bioleg foleciwlaidd oedd yn dod i'r amlwg ar y pryd. Roedd interferon, ffactor rhyddhau hormon twf, brechlyn hepatitis B, ffactor twf epidermaidd ymhlith yr enwau poeth ar eu rhestr o dargedau, ond ni lwyddodd yr un o'r ymdrechion hyn. Hyd at 1985, cloniodd Lin Fukun, gwyddonydd Tsieineaidd o Taiwan, Tsieina, genyn EPO dynol, ac yna sylweddolodd gynhyrchu EPO synthetig gan ddefnyddio technoleg ailgyfuno DNA.

Mae gan EPO dynol ailgyfunol yr un dilyniant â phrotein EPO mewndarddol, ac mae ganddo hefyd addasiad glycosyleiddiad tebyg. Yn naturiol, mae gan EPO dynol ailgyfunol hefyd weithgaredd EPO mewndarddol. Ym mis Mehefin 1989, cymeradwywyd cynnyrch cyntaf Amgen, erythropoietin dynol ailgyfunol Epogen, gan FDA yr Unol Daleithiau ar gyfer trin anemia a achosir gan fethiant arennol cronig ac anemia wrth drin haint HIV. Cyrhaeddodd gwerthiannau epogen dros $16 miliwn mewn dim ond tri mis. Dros y ddau ddegawd nesaf, roedd Amgen yn dominyddu'r farchnad ar gyfer EPO dynol a ailgynullwyd. Daeth Epogen â $2.5 biliwn mewn refeniw i Amgen yn 2010 yn unig. Yn 2018, gwerth marchnad stoc Amgen oedd $ 128.8 biliwn, gan ei wneud yr wythfed cwmni fferyllol mwyaf yn y byd.

Mae'n werth nodi bod Amgen wedi gweithio i ddechrau gyda Goldwasser i ddarparu proteinau EPO dynol wedi'u puro i'w dilyniannu, ond daeth Goldwasser ac Amgen i ben yn fuan oherwydd gwahaniaethau ideolegol. Ni feddyliodd Goldwasser a'i Brifysgol Chicago, a wnaeth ymchwil sylfaenol, roi patent ar yr hormon a ddarganfyddodd, ac felly nid ydynt wedi derbyn ceiniog am lwyddiant masnachol enfawr EPO.

Mae'n - sut mae'n symbylydd

Pan fyddwn yn anadlu, mae ocsigen yn mynd i mewn i mitocondria'r celloedd i yrru'r gadwyn resbiradol a chynhyrchu symiau enfawr o ATP, prif ffynhonnell egni ein cyrff. Nid oes gan bobl anemig ddigon o gelloedd gwaed coch iach, a'r effaith fwyaf uniongyrchol yw nad ydynt yn cymryd digon o ocsigen, sy'n gwneud iddynt deimlo'n flinedig, yn debyg i broblemau anadlu yn ystod tymor hir. Pan gânt eu chwistrellu ag EPO dynol ailgyfunol, mae cyrff cleifion anemia yn cynhyrchu mwy o gelloedd gwaed coch,cario mwy o ocsigen, a chynhyrchu mwy o'r moleciwl ynni ATP, gan leddfu'r symptomau i bob pwrpas.

Fodd bynnag, mae rhai gweithwyr chwaraeon hefyd wedi dechrau meddwl am EPO dynol ailgyfunol. Os defnyddir yr hormon ailgyfunol artiffisial o fath EPO i ysgogi corff yr athletwyr i gynhyrchu mwy o gelloedd gwaed coch, mae'n bosibl gwella gallu'r athletwyr i gael ocsigen a chynhyrchu moleciwlau ynni, a all hefyd wella perfformiad athletwyr mewn dygnwch. digwyddiadau fel beicio, rhedeg pellter hir a sgïo traws gwlad. Dangosodd papur 1980 yn y Journal of Applied Physiology y gall symbylyddion gwaed (erythropoietin, cludwyr ocsigen artiffisial a thrallwysiadau gwaed) gynyddu dygnwch 34 y cant. Os yw athletwyr yn defnyddio'r EPO, gallant redeg 8 cilomedr ar y felin draed mewn 44 eiliad yn llai o amser nag o'r blaen. Mewn gwirionedd, beicio a marathonau fu'r troseddwyr gwaethaf ar gyfer symbylyddion EPO. Yn ystod Tour de France 1998, arestiwyd meddyg tîm Sbaenaidd ar gyfer tîm Festina ar ffin Ffrainc gyda 400 o boteli o EPO ailgyfunol artiffisial! Y canlyniad, wrth gwrs, oedd i'r tîm cyfan gael ei gicio allan o'r Tour a'i wahardd.

Ychwanegodd y Pwyllgor Olympaidd Rhyngwladol EPO at ei restr waharddedig yng Ngemau Barcelona 1992, ond roedd ad-drefnu profion EPO dynol mor anodd fel nad oedd unrhyw ffordd i ganfod yn effeithiol a oedd athletwyr yn ei ddefnyddio cyn Gemau 2000. Mae yna nifer o resymau: 1) Mae cynnwys EPO mewn hylifau'r corff yn isel iawn, ac mae EPO fesul ml o waed mewn pobl arferol tua 130-230 nanogram; 2) Mae cyfansoddiad asid amino EPO ailgyfunol artiffisial yn union yr un fath â chyfansoddiad protein EPO mewndarddol dynol, dim ond ffurf glycosyleiddiad sydd ychydig yn wahanol; 3) Dim ond 5-6 awr yw hanner oes EPO yn y gwaed, ac yn gyffredinol mae'n anghanfyddadwy 4-7 diwrnod ar ôl y pigiad diwethaf; 4) Mae'r lefel EPO unigol yn wahanol iawn, felly mae'n anodd sefydlu safon feintiol absoliwt.

Ers 2000, mae WADA wedi defnyddio profion wrin fel yr unig ddull gwirio gwyddonol ar gyfer canfod EPO ailgyfunol yn uniongyrchol. Oherwydd y gwahaniaethau bach rhwng ffurf glycoylated yr EPO ailgyfunol artiffisial a ffurf yr EPO dynol, mae priodweddau gwefredig y ddau foleciwl yn fach iawn a gellir eu gwahaniaethu gan ddull electrofforesis a elwir yn ffocysu isoelectric, sef y brif strategaeth ar gyfer y canfod yr EPO ailgyfunol artiffisial yn uniongyrchol. Fodd bynnag, nid oedd rhai EPO ailgyfunol a fynegwyd gan gelloedd dynol yn dangos unrhyw wahaniaeth mewn glycosyleiddiad, felly awgrymodd rhai arbenigwyr y dylai EPO alldarddol ac EPO mewndarddol gael eu gwahaniaethu gan gynnwys isotop carbon gwahanol.

Mewn gwirionedd, mae cyfyngiadau o hyd mewn gwahanol ddulliau profi ar gyfer EPO. Er enghraifft, cyfaddefodd Lance Armstrong, y chwedl seiclo Americanaidd, iddo gymryd EPO a symbylyddion eraill yn ystod ei saith buddugoliaeth yn Tour de France, ond ni chadarnhawyd ei fod yn bositif ar gyfer EPO mewn unrhyw brawf cyffuriau bryd hynny. Mae'n rhaid i ni aros o hyd i weld a yw "un droed yn uwch" neu "un droed yn uwch".

Sut mae'n gwneud Gwobr Nobel

Gair olaf am y cysylltiad rhwng EPO a Gwobr Nobel 2019 mewn Ffisioleg neu Feddygaeth.

EPO yw'r achos mwyaf nodweddiadol o ganfyddiad ac ymateb corff dynol i hypocsia. Felly, dewisodd Semenza a Ratcliffe, dau enillydd gwobr Nobel, EPO fel y man cychwyn i astudio mecanwaith canfyddiad celloedd ac addasu i hypocsia. Y cam cyntaf oedd dod o hyd i elfennau genyn EPO a allai ymateb i newidiadau ocsigen. Nododd Semenza ddilyniant di-godio 256-sylfaen allweddol ar ben 3 'i lawr yr afon o'r EPO amgodio genyn, a enwyd yr elfen ymateb hypocsia. Os caiff y dilyniant elfen hwn ei dreiglo neu ei ddileu, mae gallu'r protein EPO i ymateb i hypocsia yn cael ei leihau'n fawr. Os caiff y dilyniant elfen hwn ei asio i ddiwedd genynnau eraill i lawr yr afon 3 nad ydynt yn gysylltiedig â hypocsia, mae'r genynnau addasedig hyn hefyd yn dangos actifadu tebyg i EPOdan amodau hypocsia.

Yna darganfu Ratcliffe a'i dîm fod yr elfen ymateb hypocsig hon nid yn unig yn bresennol yn y celloedd arennau neu'r afu sy'n gyfrifol am gynhyrchu EPO, ond hefyd mewn llawer o fathau o gelloedd eraill a all weithredu o dan amodau hypocsig. Mewn geiriau eraill, efallai na fydd yr ymateb hwn i hypocsia yn benodol i EPO, ond yn hytrach yn ffenomen ehangach mewn celloedd. Rhaid i'r celloedd eraill hyn, nad ydynt yn gyfrifol am gynhyrchu EPO, gynnwys moleciwlau (fel ffactorau trawsgrifio sy'n gyfrifol am droi mynegiant genynnau ymlaen) sy'n synhwyro newidiadau mewn crynodiad ocsigen ac yn rhwymo i elfennau ymateb hypocsig i droi genynnau fel EPO ymlaen.