De tre vindere af Nobelprisen i 2019 i fysiologi eller medicin, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza og Sir Peter J. Ratcliffe havde allerede vundet 2016 Lasker-prisen i grundlæggende medicin for deres arbejde med, hvordan celler sanser og tilpasser sig til hypoxi, så det var ikke særlig overraskende. De opdagede og identificerede nøglemolekylet hypoxi-inducerbar faktor 1 (HIF-1). I dag ønsker vi at gå tilbage til undersøgelsens oprindelse, som er erythropoietin eller EPO, et mirakelmolekyle.
Det er den vigtigste faktor i produktionen af røde blodlegemer
Røde blodlegemer er den mest udbredte type blodlegemer i blodet og er det vigtigste medium til transport af ilt og kuldioxid gennem hvirveldyrs blod. Erytrocytter dannes i knoglemarven: Hæmatopoietiske stamceller prolifererer først og differentierer sig til progenitorer af forskellige blodceller, og erythroide stamceller kan yderligere differentiere og modnes til erytrocytter. Under normale forhold er human erytrocytproduktion meget lav, men under stress som blødning, hæmolyse og hypoxi kan hastigheden af erytrocytproduktion øges med op til otte gange. I denne proces er erythropoietin EPO en af de vigtigste faktorer.
EPO er et hormon syntetiseret hovedsageligt i nyrerne. Dets kemiske natur er et stærkt glykosyleret protein. Hvorfor i nyrerne? Omkring en liter blod strømmer gennem nyrerne hvert minut, så de hurtigt og effektivt kan registrere ændringer i iltniveauet i blodet. Når iltniveauet i blodet er lavt, reagerer nyrerne hurtigt og producerer store mængder EPO. Sidstnævnte cirkulerer gennem blodbanen til knoglemarven, hvor det fremmer omdannelsen af erythroide progenitorceller til røde blodlegemer. Modne røde blodlegemer frigives fra knoglemarven til kredsløbssystemet for at forbedre kroppens evne til at binde sig til ilt. Når nyrerne mærker en stigning i ilt i blodet, reducerer de EPO-produktionen, hvilket igen reducerer mængden af røde blodlegemer i knoglemarven.
Dette giver en perfekt justeringsløkke. Mennesker, der bor i stor højde og nogle anæmipatienter, støder dog ofte på tilstanden med kontinuerligt lavt iltniveau i blodet, hvilket ikke kan fuldføre ovenstående cirkulation og stimulere nyrerne til løbende at udskille EPO, således at blodets EPO-koncentration er højere end almindelige mennesker.
Det tog næsten 80 år at afsløre det
Som mange store opdagelser har videnskabsmænds forståelse af EPO ikke været problemfri, med spørgsmål og udfordringer undervejs. Det tog næsten 80 år fra konceptet med EPO til den endelige bestemmelse af det specifikke molekyle.
I 1906 injicerede franske videnskabsmænd Carnot og Deflandre normale kaniner med serum fra anæmiske kaniner og fandt ud af, at antallet af røde blodlegemer i plasmaet af normale kaniner steg. De mente, at nogle humorale faktorer i plasmaet kunne stimulere og regulere produktionen af røde blodlegemer. Dette var den første EPO-konceptprototype. Desværre er resultaterne ikke blevet replikeret i de efterfølgende årtier, primært fordi antallet af nye røde blodlegemer ikke var nøjagtigt.
Reissmann og Ruhenstroth-Bauers parabioseeksperiment i 1950 gav virkelig stærke beviser. De koblede kirurgisk sammen kredsløbssystemerne hos to levende rotter, idet de placerede den ene i et hypoxisk miljø, og den anden indåndede normal luft. Som et resultat producerede begge mus enorme mængder røde blodlegemer. Der er ingen tvivl om, at der er et hormon i blodbanen, som stimulerer produktionen af røde blodlegemer, som EPO har fået sit navn fra. På den anden side er EPO meget følsom over for hypoxi.
Hvilket molekyle er EPO? Det tog den amerikanske videnskabsmand Goldwasser 30 år for endelig at afklare problemet på det biokemiske niveau. Hvis en arbejder vil gøre et godt stykke arbejde, skal han først slibe sit værktøj. Funktionen af EPO er at stimulere nye røde blodlegemer, menoptællingen af sidstnævnte er ikke nøjagtig. Det vigtigste funktionelle molekyle i røde blodlegemer er hæmoglobinholdigt hæm, som indeholder en jernholdig ion i centrum. Så Goldwassers team mærkede nyfødte røde blodlegemer med radioaktive jernisotoper og udviklede en følsom metode til at påvise EPO-aktivitet. Dette gør det muligt at isolere og oprense meget lave koncentrationer af EPO (nanogram pr. milliliter) fra dyrevæskeprøver. Men isolationen af EPO var ekstremt vanskelig. De skiftede fra nyre- til anæmisk fåreplasma, til urinen fra patienter med alvorlig jernmangel på grund af hageormsinfektion, og endelig rensede de i 1977 8 milligram humant EPO-protein fra 2.550 liter urin fra japanske patienter med aplastisk anæmi.
I 1985 blev proteinsekventeringen og genkloningen af humant EPO afsluttet. EPO-genet koder for et polypeptid med 193 aminorester, som bliver et modent protein sammensat af 166 aminosyrerester, efter at signalpeptidet er klippet under sekretion, og indeholder 4 steder for glykosyleringsmodifikation. I 1998 blev NMR-opløsningsstrukturen af EPO og krystalstrukturen af EPO og dets receptorkompleks analyseret. På dette tidspunkt har folk den mest intuitive forståelse af EPO.
Indtil nu har behandling for anæmi normalt krævet blodtransfusioner for at genopbygge manglen på røde blodlegemer. Efterhånden som folk lærer mere om EPO, har indsprøjtning af det for at stimulere produktionen af røde blodlegemer i deres egen knoglemarv gjort problemet lettere. Men at rense EPO direkte fra kropsvæsker, som Goldwasser gjorde, er vanskeligt, og udbyttet er lavt. Bestemmelsen af EPO-protein og gensekvens gjorde det muligt at producere rekombinant humant EPO i store mængder.
Det blev udført af et bioteknologifirma ved navn Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen blev grundlagt i 1980 med kun syv medlemmer i håb om at lave biofarmaceutiske produkter med de dengang nye teknikker inden for molekylærbiologi. Interferon, væksthormonfrigørende faktor, hepatitis B-vaccine, epidermal vækstfaktor var blandt de varme navne på deres liste over mål, men ingen af disse forsøg lykkedes. Indtil 1985 klonede Lin Fukun, en kinesisk videnskabsmand fra Taiwan, Kina, genet af humant EPO og realiserede derefter produktionen af syntetisk EPO ved hjælp af DNA-rekombinationsteknologi.
Rekombinant humant EPO har samme sekvens som endogent EPO-protein og har også lignende glykosyleringsmodifikation. Naturligvis har rekombinant humant EPO også aktiviteten af endogent EPO. I juni 1989 blev Amgens første produkt, rekombinant humant erythropoietin Epogen, godkendt af US FDA til behandling af anæmi forårsaget af kronisk nyresvigt og anæmi i behandlingen af HIV-infektion. Salget af Epogen toppede $16 millioner på kun tre måneder. I løbet af de næste to årtier dominerede Amgen markedet for gensamlet menneskelig EPO. Epogen indbragte Amgen 2,5 milliarder dollars i omsætning alene i 2010. I 2018 var Amgens aktiemarkedsværdi $128,8 milliarder, hvilket gør det til den ottende største medicinalvirksomhed i verden.
Det er værd at bemærke, at Amgen oprindeligt arbejdede med Goldwasser for at levere oprensede humane EPO-proteiner til sekventering, men Goldwasser og Amgen faldt hurtigt ud på grund af ideologiske forskelle. Goldwasser og hans University of Chicago, der lavede grundforskning, har aldrig tænkt på at patentere det hormon, han opdagede, og har derfor ikke modtaget en krone for EPO's store kommercielle succes.
Det -- hvordan er det et stimulerende middel
Når vi trækker vejret, kommer ilt ind i cellernes mitokondrier for at drive åndedrætskæden og producere enorme mængder ATP, den vigtigste energikilde i vores kroppe. Anæmiske mennesker har ikke nok sunde røde blodlegemer, og den mest umiddelbare effekt er, at de ikke optager nok ilt, hvilket får dem til at føle sig trætte, svarende til vejrtrækningsproblemer under en længere periode. Når de injiceres med rekombinant humant EPO, producerer anæmipatienters kroppe flere røde blodlegemer,bære mere ilt og producere mere af energimolekylet ATP, hvilket effektivt lindrer symptomerne.
Nogle sportsarbejdere er dog også begyndt at tænke på rekombinant humant EPO. Hvis det kunstige rekombinante hormon af EPO-typen bruges til at stimulere atleternes krop til at producere flere røde blodlegemer, er det muligt at forbedre atleternes evne til at få ilt og producere energimolekyler, hvilket også kan forbedre atleternes præstationer i udholdenhed begivenheder som cykling, langdistanceløb og langrend. Et papir fra 1980 i Journal of Applied Physiology viste, at blodstimulerende midler (erythropoietin, kunstige iltbærere og blodtransfusioner) kan øge udholdenheden med 34 procent. Hvis atleter bruger EPO, kan de løbe 8 kilometer på løbebåndet på 44 sekunder kortere tid end før. Faktisk har cykling og maraton været de værste krænkere for EPO-stimulerende midler. Under Tour de France i 1998 blev en spansk holdlæge for Festina-holdet arresteret ved den franske grænse med 400 flasker kunstig rekombinant EPO! Resultatet var selvfølgelig, at hele holdet blev smidt ud af Touren og udelukket.
Den Internationale Olympiske Komité føjede EPO til sin forbudte liste ved legene i Barcelona i 1992, men at omorganisere menneskelig EPO-testning var så vanskelig, at der før legene i 2000 ikke var nogen måde effektivt at opdage, om atleter brugte det. Der er flere årsager: 1) EPO-indholdet i kropsvæsker er meget lavt, og EPO pr. ml blod hos normale mennesker er omkring 130-230 nanogram; 2) Aminosyresammensætningen af kunstigt rekombinant EPO er nøjagtig den samme som for humant endogent EPO-protein, kun formen for glycosylering er meget lidt anderledes; 3) Halveringstiden for EPO i blodet er kun 5-6 timer, og den er generelt uopdagelig 4-7 dage efter den sidste injektion; 4) Det individuelle EPO-niveau er meget forskelligt, så det er svært at etablere en absolut kvantitativ standard.
Siden 2000 har WADA brugt urintest som den eneste videnskabelige verifikationsmetode til direkte påvisning af rekombinant EPO. På grund af de små forskelle mellem den glycoylerede form af det kunstige rekombinante EPO og den humane EPO, er de ladede egenskaber af de to molekyler meget små og kan skelnes ved en elektroforesemetode kaldet isoelektrisk fokusering, som er hovedstrategien for direkte påvisning af det kunstige rekombinante EPO. Imidlertid viste nogle rekombinante EPO udtrykt af humant afledte celler ingen forskel i glycosylering, så nogle eksperter foreslog, at eksogent EPO og endogent EPO skulle skelnes ved forskelligt indhold af kulstofisotop.
Faktisk er der stadig begrænsninger i forskellige testmetoder for EPO. For eksempel indrømmede Lance Armstrong, den amerikanske cykellegende, at have taget EPO og andre stimulanser under sine syv Tour de France-sejre, men han blev faktisk ikke bekræftet positiv for EPO i nogen dopingtest på det tidspunkt. Vi må stadig vente og se, om det er "en fod højere" eller "en fod højere".
Hvordan bliver det til en Nobelpris
Et sidste ord om sammenhængen mellem EPO og 2019 Nobelprisen i fysiologi eller medicin.
EPO er det mest typiske tilfælde af menneskekroppens opfattelse og reaktion på hypoxi. Derfor valgte Semenza og Ratcliffe, to nobelpristagere, EPO som udgangspunkt for at studere mekanismen for celleopfattelse og tilpasning til hypoxi. Det første skridt var at finde de elementer i EPO-genet, der kunne reagere på iltændringer. Semenza identificerede en ikke-kodende nøglesekvens på 256 baser i 3'-nedstrømsenden af genet, der koder for EPO, kaldet hypoxiresponselementet. Hvis denne elementsekvens er muteret eller deleteret, reduceres EPO-proteinets evne til at reagere på hypoxi kraftigt. Hvis denne elementsekvens er fusioneret til nedstrøms 3'-enden af andre gener, der ikke er forbundet med hypoxi, viser disse modificerede gener også EPO-lignende aktiveringunder hypoxitilstande.
Ratcliffe og hans team opdagede derefter, at dette hypoxiske responselement ikke kun er til stede i nyre- eller levercellerne, der er ansvarlige for produktionen af EPO, men også i mange andre celletyper, der kan fungere under hypoksiske forhold. Med andre ord er denne reaktion på hypoxi muligvis ikke specifik for EPO, men snarere et mere udbredt fænomen i celler. Disse andre celler, som ikke er ansvarlige for EPO-produktion, skal indeholde molekyler (såsom transkriptionsfaktorer, der er ansvarlige for at aktivere genekspression), der registrerer ændringer i iltkoncentrationen og binder sig til hypoxiske responselementer for at tænde gener såsom EPO.
