Die drei Gewinner des Nobelpreises für Physiologie oder Medizin 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza und Sir Peter J. Ratcliffe, hatten bereits 2016 den Lasker-Preis für Grundlagenmedizin für ihre Arbeiten darüber, wie Zellen wahrnehmen und sich anpassen, gewonnen zu Hypoxie, also war es nicht besonders überraschend. Sie entdeckten und identifizierten das Schlüsselmolekül Hypoxie-induzierbarer Faktor 1 (HIF-1). Heute wollen wir zum Ursprung der Studie zurückkehren, nämlich Erythropoietin oder EPO, ein Wundermolekül.

Es ist der wichtigste Faktor bei der Produktion roter Blutkörperchen

Rote Blutkörperchen sind die am häufigsten vorkommende Art von Blutkörperchen im Blut und das Hauptmedium für den Transport von Sauerstoff und Kohlendioxid durch das Blut von Wirbeltieren. Erythrozyten werden im Knochenmark gebildet: Hämatopoetische Stammzellen vermehren sich zunächst und differenzieren sich zu Vorläufern verschiedener Blutzellen, und erythroide Vorläufer können sich weiter differenzieren und zu Erythrozyten heranreifen. Unter normalen Bedingungen ist die Produktionsrate menschlicher Erythrozyten sehr niedrig, aber unter Stress wie Blutungen, Hämolyse und Hypoxie kann die Produktionsrate der Erythrozyten um das bis zu Achtfache erhöht werden. Erythropoietin EPO ist dabei einer der wichtigsten Faktoren.

EPO ist ein Hormon, das hauptsächlich in der Niere synthetisiert wird. Seine chemische Natur ist ein stark glykosyliertes Protein. Warum in den Nieren? Etwa ein Liter Blut fließt jede Minute durch die Nieren, sodass sie Änderungen des Sauerstoffgehalts im Blut schnell und effizient erkennen können. Wenn der Sauerstoffgehalt im Blut niedrig ist, reagieren die Nieren schnell und produzieren große Mengen an EPO. Letzteres gelangt über die Blutbahn ins Knochenmark, wo es die Umwandlung von erythroiden Vorläuferzellen in rote Blutkörperchen fördert. Reife rote Blutkörperchen werden aus dem Knochenmark in das Kreislaufsystem freigesetzt, um die Fähigkeit des Körpers, Sauerstoff zu binden, zu verbessern. Wenn die Nieren einen Anstieg des Sauerstoffgehalts im Blut wahrnehmen, reduzieren sie die EPO-Produktion, was wiederum die Menge an roten Blutkörperchen im Knochenmark verringert.

Dies ergibt eine perfekte Anpassungsschleife. Menschen, die in großer Höhe leben, und einige Anämiepatienten treffen jedoch häufig auf den Zustand eines kontinuierlich niedrigen Blutsauerstoffspiegels, der die oben genannte Zirkulation nicht vervollständigen und die Niere dazu anregen kann, kontinuierlich EPO abzusondern, so dass die EPO-Konzentration im Blut höher ist als bei gewöhnlichen Menschen.

Es dauerte fast 80 Jahre, um es aufzudecken

Wie bei vielen großen Entdeckungen verlief das Verständnis der Wissenschaftler für EPO nicht reibungslos, mit Fragen und Herausforderungen auf dem Weg. Vom Konzept des EPO bis zur endgültigen Bestimmung des spezifischen Moleküls vergingen fast 80 Jahre.

1906 injizierten die französischen Wissenschaftler Carnot und Deflandre normalen Kaninchen das Serum anämischer Kaninchen und stellten fest, dass die Anzahl der roten Blutkörperchen im Plasma normaler Kaninchen anstieg. Sie glaubten, dass einige humorale Faktoren im Plasma die Produktion von roten Blutkörperchen stimulieren und regulieren könnten. Dies war der erste EPO-Konzeptprototyp. Leider wurden die Ergebnisse in den folgenden Jahrzehnten nicht repliziert, hauptsächlich weil die Zählung neuer roter Blutkörperchen nicht genau war.

Das Parabiose-Experiment von Reissmann und Ruhenstroth-Bauer aus dem Jahr 1950 lieferte wirklich starke Beweise. Sie verbanden chirurgisch die Kreislaufsysteme von zwei lebenden Ratten, indem sie eine in eine hypoxische Umgebung brachten und die andere normale Luft atmete. Als Ergebnis produzierten beide Mäuse riesige Mengen an roten Blutkörperchen. Es besteht kein Zweifel, dass es im Blutkreislauf ein Hormon gibt, das die Produktion roter Blutkörperchen anregt, woher EPO seinen Namen hat. Andererseits ist EPO sehr empfindlich gegenüber Hypoxie.

Welches Molekül ist EPO? Der amerikanische Wissenschaftler Goldwasser brauchte 30 Jahre, um das Problem auf biochemischer Ebene endgültig zu klären. Wenn ein Arbeiter gute Arbeit leisten will, muss er zuerst seine Werkzeuge schärfen. Die Funktion von EPO besteht jedoch darin, neue rote Blutkörperchen zu stimulierendie Zählung der letzteren ist nicht genau. Das wichtigste funktionelle Molekül in roten Blutkörperchen ist Hämoglobin, das Häm enthält, das in seinem Zentrum ein Eisen(II)-Ion enthält. Also markierte Goldwassers Team neugeborene rote Blutkörperchen mit radioaktiven Eisenisotopen und entwickelte eine empfindliche Methode zum Nachweis der EPO-Aktivität. Dadurch ist es möglich, sehr geringe EPO-Konzentrationen (Nanogramm pro Milliliter) aus tierischen Flüssigkeitsproben zu isolieren und zu reinigen. Aber die Isolierung von EPO war äußerst schwierig. Sie wechselten von Nierenplasma zu anämischem Schafsplasma, zum Urin von Patienten mit schwerem Eisenmangel aufgrund einer Hakenwurminfektion und reinigten schließlich 1977 8 Milligramm menschliches EPO-Protein aus 2.550 Liter Urin japanischer Patienten mit aplastischer Anämie.

1985 wurden die Proteinsequenzierung und Genklonierung von menschlichem EPO abgeschlossen. Das EPO-Gen codiert ein Polypeptid mit 193 Aminosäureresten, das zu einem reifen Protein wird, das aus 166 Aminosäureresten besteht, nachdem das Signalpeptid während der Sekretion gekürzt wurde, und 4 Stellen für die Glykosylierungsmodifikation enthält. 1998 wurden die NMR-Lösungsstruktur von EPO und die Kristallstruktur von EPO und seinem Rezeptorkomplex analysiert. An diesem Punkt haben die Menschen das intuitivste Verständnis von EPO.

Bisher erforderte die Behandlung einer Anämie normalerweise Bluttransfusionen, um den Mangel an roten Blutkörperchen auszugleichen. Da die Menschen mehr über EPO erfahren, hat die Injektion zur Stimulierung der Produktion roter Blutkörperchen in ihrem eigenen Knochenmark das Problem erleichtert. Aber EPO direkt aus Körperflüssigkeiten zu reinigen, wie es Goldwasser tat, ist schwierig und die Ausbeute gering. Die Bestimmung des EPO-Proteins und der Gensequenz ermöglichte es, rekombinantes menschliches EPO in großen Mengen herzustellen.

Es wurde von einem Biotechnologieunternehmen namens Applied Molecular Genetics (Amgen) durchgeführt. Amgen wurde 1980 mit nur sieben Mitgliedern gegründet, in der Hoffnung, Biopharmazeutika mit den damals aufkommenden Techniken der Molekularbiologie herzustellen. Interferon, Wachstumshormon-freisetzender Faktor, Hepatitis-B-Impfstoff, epidermaler Wachstumsfaktor gehörten zu den heißen Namen auf ihrer Liste von Zielen, aber keiner dieser Versuche war erfolgreich. Bis 1985 klonte Lin Fukun, ein chinesischer Wissenschaftler aus Taiwan, China, das Gen des menschlichen EPO und realisierte dann die Herstellung von synthetischem EPO unter Verwendung der DNA-Rekombinationstechnologie.

Rekombinantes menschliches EPO hat die gleiche Sequenz wie endogenes EPO-Protein und hat auch eine ähnliche Glykosylierungsmodifikation. Natürlich hat rekombinantes menschliches EPO auch die Aktivität von endogenem EPO. Im Juni 1989 wurde Amgens erstes Produkt, rekombinantes humanes Erythropoietin Epogen, von der US-amerikanischen FDA für die Behandlung von Anämie, die durch chronisches Nierenversagen verursacht wird, und Anämie bei der Behandlung von HIV-Infektionen zugelassen. Der Epogen-Umsatz überstieg in nur drei Monaten 16 Millionen US-Dollar. In den nächsten zwei Jahrzehnten dominierte Amgen den Markt für reassembliertes menschliches EPO. Epogen brachte Amgen allein im Jahr 2010 Einnahmen in Höhe von 2,5 Milliarden US-Dollar ein. Im Jahr 2018 betrug der Börsenwert von Amgen 128,8 Milliarden US-Dollar und ist damit das achtgrößte Pharmaunternehmen der Welt.

Es ist erwähnenswert, dass Amgen zunächst mit Goldwasser zusammenarbeitete, um gereinigte menschliche EPO-Proteine ​​für die Sequenzierung bereitzustellen, aber Goldwasser und Amgen zerstritten sich bald aufgrund ideologischer Differenzen. Goldwasser und seine University of Chicago, die Grundlagenforschung betrieben, dachten nie daran, das von ihm entdeckte Hormon zu patentieren, und haben daher keinen Cent für den enormen kommerziellen Erfolg von EPO erhalten.

Es – wie ist es ein Stimulans?

Wenn wir atmen, gelangt Sauerstoff in die Mitochondrien der Zellen, um die Atmungskette anzutreiben und riesige Mengen an ATP zu produzieren, der Hauptenergiequelle in unserem Körper. Anämische Menschen haben nicht genügend gesunde rote Blutkörperchen, und die unmittelbarste Folge ist, dass sie nicht genug Sauerstoff aufnehmen, was sie müde macht, ähnlich wie Atemprobleme während eines langen Laufs. Wenn rekombinantes menschliches EPO injiziert wird, produziert der Körper von Anämiepatienten mehr rote Blutkörperchen,transportieren mehr Sauerstoff und produzieren mehr des Energiemoleküls ATP, wodurch die Symptome effektiv gelindert werden.

Einige Sportwissenschaftler haben jedoch auch begonnen, an rekombinantes menschliches EPO zu denken. Wenn das künstliche rekombinante Hormon vom EPO-Typ verwendet wird, um den Körper des Athleten zu stimulieren, mehr rote Blutkörperchen zu produzieren, ist es möglich, die Fähigkeit des Athleten zu verbessern, Sauerstoff zu erhalten und Energiemoleküle zu produzieren, was auch die Leistung von Athleten im Ausdauerbereich verbessern kann Veranstaltungen wie Radsport, Langstreckenlauf und Langlauf. Ein Artikel aus dem Jahr 1980 im Journal of Applied Physiology zeigte, dass Blutstimulanzien (Erythropoietin, künstliche Sauerstoffträger und Bluttransfusionen) die Ausdauer um 34 Prozent steigern können. Nutzen Sportler das EPO, können sie 8 Kilometer auf dem Laufband in 44 Sekunden weniger Zeit laufen als bisher. Tatsächlich waren Radfahren und Marathons die schlimmsten Übeltäter für EPO-Stimulanzien. Während der Tour de France 1998 wurde ein spanischer Mannschaftsarzt des Festina-Teams an der französischen Grenze mit 400 Flaschen künstlich rekombinantem EPO festgenommen! Das Ergebnis war natürlich, dass das gesamte Team von der Tour geworfen und gesperrt wurde.

Das Internationale Olympische Komitee hat EPO bei den Spielen von Barcelona 1992 auf seine Verbotsliste gesetzt, aber die Reorganisation von menschlichen EPO-Tests war so schwierig, dass es vor den Spielen 2000 keine Möglichkeit gab, effektiv festzustellen, ob Athleten es verwendeten. Dafür gibt es mehrere Gründe: 1) Der EPO-Gehalt in Körperflüssigkeiten ist sehr gering, und EPO pro ml Blut beträgt bei normalen Menschen etwa 130–230 Nanogramm; 2) Die Aminosäurezusammensetzung von künstlichem rekombinantem EPO ist genau die gleiche wie die von menschlichem endogenem EPO-Protein, nur die Form der Glykosylierung ist sehr leicht unterschiedlich; 3) Die Halbwertszeit von EPO im Blut beträgt nur 5–6 Stunden und ist im Allgemeinen 4–7 Tage nach der letzten Injektion nicht mehr nachweisbar; 4) Das individuelle EPA-Niveau ist sehr unterschiedlich, daher ist es schwierig, einen absoluten quantitativen Standard festzulegen.

Seit dem Jahr 2000 verwendet die WADA den Urintest als einzige wissenschaftliche Nachweismethode zum direkten Nachweis von rekombinantem EPO. Aufgrund der geringfügigen Unterschiede zwischen der glykoylierten Form des künstlichen rekombinanten EPO und der des menschlichen EPO sind die geladenen Eigenschaften der beiden Moleküle sehr gering und können durch eine Elektrophoresemethode namens isoelektrische Fokussierung unterschieden werden, die die Hauptstrategie für die ist direkter Nachweis des künstlichen rekombinanten EPO. Einige rekombinante EPO, die von humanen Zellen exprimiert wurden, zeigten jedoch keinen Unterschied in der Glykosylierung, weshalb einige Experten vorschlugen, dass exogenes EPO und endogenes EPO durch unterschiedliche Kohlenstoffisotopengehalte unterschieden werden sollten.

Tatsächlich gibt es immer noch Einschränkungen bei verschiedenen Testmethoden für EPO. Zum Beispiel gab Lance Armstrong, die amerikanische Radsportlegende, zu, während seiner sieben Siege bei der Tour de France EPO und andere Stimulanzien eingenommen zu haben, aber er wurde zu diesem Zeitpunkt in keinem Dopingtest als positiv für EPO bestätigt. Ob es „one foot higher“ oder „one foot higher“ ist, müssen wir noch abwarten.

Wie macht man einen Nobelpreis

Ein letztes Wort zum Zusammenhang zwischen dem EPA und dem Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 2019.

EPO ist der typischste Fall der Wahrnehmung und Reaktion des menschlichen Körpers auf Hypoxie. Daher wählten Semenza und Ratcliffe, zwei Nobelpreisträger, EPO als Ausgangspunkt, um den Mechanismus der Zellwahrnehmung und Anpassung an Hypoxie zu untersuchen. Der erste Schritt bestand darin, die Elemente des EPO-Gens zu finden, die auf Sauerstoffveränderungen reagieren könnten. Semenza identifizierte eine 256 Basen lange nichtkodierende Schlüsselsequenz am stromabwärts gelegenen 3'-Ende des für EPO kodierenden Gens, das als Hypoxie-Reaktionselement bezeichnet wird. Wenn diese Elementsequenz mutiert oder deletiert ist, ist die Fähigkeit des EPO-Proteins, auf Hypoxie zu reagieren, stark reduziert. Wenn diese Elementsequenz mit dem stromabwärts gelegenen 3'-Ende anderer Gene fusioniert ist, die nicht mit Hypoxie assoziiert sind, zeigen diese modifizierten Gene auch eine EPO-ähnliche Aktivierungunter Hypoxiebedingungen.

Ratcliffe und sein Team entdeckten dann, dass dieses hypoxische Reaktionselement nicht nur in den für die Produktion von EPO verantwortlichen Nieren- oder Leberzellen vorhanden ist, sondern auch in vielen anderen Zelltypen, die unter hypoxischen Bedingungen funktionieren können. Mit anderen Worten, diese Reaktion auf Hypoxie ist möglicherweise nicht spezifisch für EPO, sondern eher ein weit verbreitetes Phänomen in Zellen. Diese anderen Zellen, die nicht für die EPO-Produktion verantwortlich sind, müssen Moleküle enthalten (z. B. Transkriptionsfaktoren, die für das Einschalten der Genexpression verantwortlich sind), die Änderungen der Sauerstoffkonzentration wahrnehmen und an hypoxische Reaktionselemente binden, um Gene wie EPO einzuschalten.