Los tres ganadores del Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza y Sir Peter J. Ratcliffe, ya habían ganado el Premio Lasker de Medicina Básica de 2016 por su trabajo sobre cómo las células perciben y se adaptan. a la hipoxia, por lo que no fue particularmente sorprendente. Descubrieron e identificaron la molécula clave del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1). Hoy queremos volver al origen del estudio, que es la eritropoyetina, o EPO, una molécula milagrosa.
Es el factor más importante en la producción de glóbulos rojos.
Los glóbulos rojos son el tipo de glóbulos más abundante en la sangre y son el medio principal para transportar oxígeno y dióxido de carbono a través de la sangre de los vertebrados. Los eritrocitos se generan en la médula ósea: las células madre hematopoyéticas primero proliferan y se diferencian en progenitores de varias células sanguíneas, y los progenitores eritroides pueden diferenciarse y madurar en eritrocitos. En condiciones normales, la tasa de producción de eritrocitos humanos es muy baja, pero bajo situaciones de estrés como sangrado, hemólisis e hipoxia, la tasa de producción de eritrocitos puede aumentar hasta ocho veces. En este proceso, la eritropoyetina EPO es uno de los factores más importantes.
La EPO es una hormona sintetizada principalmente en el riñón. Su naturaleza química es una proteína altamente glicosilada. ¿Por qué en los riñones? Alrededor de un litro de sangre fluye a través de los riñones cada minuto, por lo que pueden detectar cambios en los niveles de oxígeno en la sangre de manera rápida y eficiente. Cuando los niveles de oxígeno en la sangre son bajos, los riñones responden rápidamente y producen grandes cantidades de EPO. Este último circula por el torrente sanguíneo hasta la médula ósea, donde promueve la conversión de las células progenitoras eritroides en glóbulos rojos. Los glóbulos rojos maduros se liberan de la médula ósea al sistema circulatorio para mejorar la capacidad del cuerpo para unirse al oxígeno. Cuando los riñones detectan un aumento de oxígeno en la sangre, reducen la producción de EPO, lo que a su vez reduce la cantidad de glóbulos rojos en la médula ósea.
Esto hace un bucle de ajuste perfecto. Sin embargo, las personas que viven a gran altura y algunos pacientes con anemia a menudo se encuentran con la condición de un nivel de oxígeno en sangre continuamente bajo, que no puede completar la circulación anterior y estimular al riñón para que secrete continuamente EPO, por lo que la concentración de EPO en sangre es más alta que la de la gente común.
Tomó casi 80 años descubrirlo.
Al igual que muchos descubrimientos importantes, la comprensión de la EPO por parte de los científicos no ha sido fácil, con preguntas y desafíos en el camino. Pasaron casi 80 años desde el concepto de EPO hasta la determinación final de la molécula específica.
En 1906, los científicos franceses Carnot y Deflandre inyectaron suero de conejos anémicos a conejos normales y descubrieron que aumentaba el recuento de glóbulos rojos en el plasma de conejos normales. Creían que algunos factores humorales en el plasma podrían estimular y regular la producción de glóbulos rojos. Este fue el primer prototipo del concepto EPO. Desafortunadamente, los resultados no se han replicado en las décadas posteriores, principalmente porque el recuento de glóbulos rojos nuevos no fue preciso.
El experimento de parabiosis de Reissmann y Ruhenstroth-Bauer en 1950 proporcionó pruebas realmente sólidas. Conectaron quirúrgicamente los sistemas circulatorios de dos ratas vivas, colocando una en un ambiente hipóxico y la otra respirando aire normal. Como resultado, ambos ratones produjeron cantidades masivas de glóbulos rojos. No hay duda de que existe una hormona en el torrente sanguíneo que estimula la producción de glóbulos rojos, de donde la EPO recibe su nombre. Por otro lado, la EPO es muy sensible a la hipoxia.
¿Qué molécula es la EPO? El científico estadounidense Goldwasser tardó 30 años en aclarar finalmente el problema a nivel bioquímico. Si un trabajador quiere hacer un buen trabajo, primero debe afilar sus herramientas. La función de la EPO es estimular nuevos glóbulos rojos, peroel recuento de este último no es exacto. La molécula funcional más importante en los glóbulos rojos es la hemoglobina que contiene hemo, que contiene un ion ferroso en su centro. Entonces, el equipo de Goldwasser marcó los glóbulos rojos de los recién nacidos con isótopos de hierro radiactivos y desarrolló un método sensible para detectar la actividad de la EPO. Esto hace posible aislar y purificar concentraciones muy bajas de EPO (nanogramos por mililitro) de muestras de fluidos animales. Pero el aislamiento de EPO fue extremadamente difícil. Pasaron del riñón al plasma anémico de oveja, a la orina de pacientes con deficiencia severa de hierro debido a la anquilostomiasis y finalmente, en 1977, purificaron 8 miligramos de proteína EPO humana de 2550 litros de orina de pacientes japoneses con anemia aplásica.
En 1985, se completaron la secuenciación de proteínas y la clonación de genes de EPO humana. El gen EPO codifica un polipéptido con 193 residuos amino, que se convierte en una proteína madura compuesta por 166 residuos aminoacídicos después de que el péptido señal se corta durante la secreción y contiene 4 sitios para la modificación de la glicosilación. En 1998, se analizaron la estructura de solución de RMN de EPO y la estructura cristalina de EPO y su complejo receptor. En este punto, las personas tienen la comprensión más intuitiva de la EPO.
Hasta ahora, el tratamiento de la anemia generalmente requería transfusiones de sangre para reponer la deficiencia de glóbulos rojos. A medida que las personas aprenden más sobre la EPO, inyectarla para estimular la producción de glóbulos rojos en su propia médula ósea ha facilitado el problema. Pero purificar la EPO directamente de los fluidos corporales, como hizo Goldwasser, es difícil y los rendimientos son bajos. La determinación de la proteína EPO y la secuencia del gen hizo posible producir EPO humana recombinante en grandes cantidades.
Fue realizado por una empresa de biotecnología llamada Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen se fundó en 1980 con solo siete miembros, con la esperanza de fabricar productos biofarmacéuticos con las técnicas emergentes de biología molecular. El interferón, el factor liberador de la hormona del crecimiento, la vacuna contra la hepatitis B y el factor de crecimiento epidérmico se encontraban entre los nombres candentes en su lista de objetivos, pero ninguno de estos intentos tuvo éxito. Hasta 1985, Lin Fukun, un científico chino de Taiwán, China, clonó el gen de la EPO humana y luego realizó la producción de EPO sintética utilizando tecnología de recombinación de ADN.
La EPO humana recombinante tiene la misma secuencia que la proteína EPO endógena y también tiene una modificación de glicosilación similar. Naturalmente, la EPO humana recombinante también tiene la actividad de la EPO endógena. En junio de 1989, la FDA de EE. UU. aprobó el primer producto de Amgen, la eritropoyetina humana recombinante Epogen, para el tratamiento de la anemia causada por insuficiencia renal crónica y la anemia en el tratamiento de la infección por VIH. Las ventas de Epogen superaron los $16 millones en solo tres meses. Durante las siguientes dos décadas, Amgen dominó el mercado de la EPO humana reensamblada. Epogen aportó a Amgen 2500 millones de dólares en ingresos solo en 2010. En 2018, el valor bursátil de Amgen fue de 128 800 millones de dólares, lo que la convirtió en la octava compañía farmacéutica más grande del mundo.
Vale la pena señalar que Amgen trabajó inicialmente con Goldwasser para proporcionar proteínas EPO humanas purificadas para la secuenciación, pero Goldwasser y Amgen pronto se separaron debido a diferencias ideológicas. Goldwasser y su Universidad de Chicago, que realizaron investigaciones básicas, nunca pensaron en patentar la hormona que descubrió, por lo que no han recibido ni un centavo por el enorme éxito comercial de la EPO.
¿Cómo es que es un estimulante?
Cuando respiramos, el oxígeno ingresa a las mitocondrias de las células para impulsar la cadena respiratoria y producir cantidades masivas de ATP, la principal fuente de energía de nuestro cuerpo. Las personas anémicas no tienen suficientes glóbulos rojos sanos, y el efecto más inmediato es que no toman suficiente oxígeno, lo que los hace sentir cansados, similares a los problemas respiratorios durante una carrera larga. Cuando se les inyecta EPO humana recombinante, los cuerpos de los pacientes con anemia producen más glóbulos rojos,transportar más oxígeno y producir más de la molécula de energía ATP, lo que alivia eficazmente los síntomas.
Sin embargo, algunos trabajadores del deporte también han comenzado a pensar en la EPO humana recombinante. Si se utiliza la hormona recombinante artificial de tipo EPO para estimular el cuerpo de los atletas a producir más glóbulos rojos, es posible mejorar la capacidad de los atletas para obtener oxígeno y producir moléculas de energía, lo que también puede mejorar el rendimiento de los atletas en resistencia. eventos como ciclismo, carreras de fondo y esquí de fondo. Un artículo de 1980 en el Journal of Applied Physiology mostró que los estimulantes de la sangre (eritropoyetina, transportadores de oxígeno artificiales y transfusiones de sangre) pueden aumentar la resistencia en un 34 por ciento. Si los atletas usan la EPO, pueden correr 8 kilómetros en la cinta de correr en 44 segundos menos que antes. De hecho, el ciclismo y los maratones han sido los peores infractores de los estimulantes EPO. ¡Durante el Tour de Francia de 1998, un médico español del equipo Festina fue detenido en la frontera francesa con 400 botellas de EPO recombinante artificial! El resultado, por supuesto, fue que todo el equipo fue expulsado del Tour y sancionado.
El Comité Olímpico Internacional añadió EPO a su lista de sustancias prohibidas en los Juegos de Barcelona de 1992, pero reorganizar las pruebas de EPO en humanos fue tan difícil que antes de los Juegos de 2000 no había forma de detectar de manera efectiva si los atletas la estaban usando. Hay varias razones: 1) el contenido de EPO en los fluidos corporales es muy bajo, y la EPO por ml de sangre en personas normales es de aproximadamente 130-230 nanogramos; 2) La composición de aminoácidos de la EPO recombinante artificial es exactamente la misma que la de la proteína EPO endógena humana, solo que la forma de glicosilación es muy ligeramente diferente; 3) La vida media de la EPO en la sangre es de solo 5 a 6 horas, y generalmente es indetectable 4 a 7 días después de la última inyección; 4) El nivel de EPO individual es muy diferente, por lo que es difícil establecer un estándar cuantitativo absoluto.
Desde el año 2000, la AMA ha utilizado pruebas de orina como el único método de verificación científica para la detección directa de EPO recombinante. Debido a las ligeras diferencias entre la forma glicoilada de la EPO recombinante artificial y la de la EPO humana, las propiedades cargadas de las dos moléculas son muy pequeñas y se pueden distinguir mediante un método de electroforesis llamado enfoque isoeléctrico, que es la principal estrategia para la detección directa de la EPO recombinante artificial. Sin embargo, algunas EPO recombinantes expresadas por células derivadas de humanos no mostraron diferencias en la glicosilación, por lo que algunos expertos sugirieron que la EPO exógena y la EPO endógena deberían distinguirse por diferentes contenidos de isótopos de carbono.
De hecho, todavía existen limitaciones en los diferentes métodos de prueba para EPO. Por ejemplo, Lance Armstrong, la leyenda del ciclismo estadounidense, admitió haber tomado EPO y otros estimulantes durante sus siete victorias en el Tour de Francia, pero en realidad no se confirmó que tuviera EPO en ninguna prueba de dopaje en ese momento. Todavía tenemos que esperar y ver si es "un pie más alto" o "un pie más alto".
¿Cómo se hace un premio Nobel?
Una palabra final sobre la conexión entre la EPO y el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2019.
La EPO es el caso más típico de percepción y respuesta del cuerpo humano a la hipoxia. Por ello, Semenza y Ratcliffe, dos premios Nobel, eligieron la EPO como punto de partida para estudiar el mecanismo de percepción y adaptación celular a la hipoxia. El primer paso fue encontrar los elementos del gen EPO que pudieran responder a los cambios de oxígeno. Semenza identificó una secuencia clave no codificante de 256 bases en el extremo 3' aguas abajo del gen que codifica la EPO, denominada elemento de respuesta a la hipoxia. Si esta secuencia de elementos está mutada o eliminada, la capacidad de la proteína EPO para responder a la hipoxia se reduce considerablemente. Si esta secuencia de elementos se fusiona con el extremo 3 'aguas abajo de otros genes no asociados con la hipoxia, estos genes modificados también muestran una activación similar a la EPO.en condiciones de hipoxia.
Ratcliffe y su equipo descubrieron que este elemento de respuesta hipóxica no solo está presente en las células renales o hepáticas responsables de la producción de EPO, sino también en muchos otros tipos de células que pueden funcionar en condiciones hipóxicas. En otras palabras, esta respuesta a la hipoxia puede no ser específica de la EPO, sino más bien un fenómeno más generalizado en las células. Estas otras células, que no son responsables de la producción de EPO, deben contener moléculas (como factores de transcripción responsables de activar la expresión génica) que detectan cambios en la concentración de oxígeno y se unen a elementos de respuesta hipóxicos para activar genes como la EPO.
