Kolm 2019. aasta Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhinna võitjat William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza ja Sir Peter J. Ratcliffe olid juba võitnud 2016. aasta Laskeri põhimeditsiini auhinna oma töö eest, kuidas rakud tajuvad ja kohanevad. hüpoksiani, nii et see polnud eriti üllatav. Nad avastasid ja tuvastasid võtmemolekuli hüpoksiaga indutseeritava faktori 1 (HIF-1). Täna tahame minna tagasi uuringu päritolu juurde, milleks on erütropoetiin ehk EPO, imemolekul.
See on punaste vereliblede tootmise kõige olulisem tegur
Punased verelibled on veres kõige levinum vereliblede tüüp ja on peamine keskkond hapniku ja süsinikdioksiidi transportimiseks selgroogsete vere kaudu. Erütrotsüüdid tekivad luuüdis: esmalt prolifereeruvad vereloome tüvirakud ja diferentseeruvad erinevate vererakkude eellasrakud ning erütrotsüüdid võivad edasi diferentseeruda ja erütrotsüütideks küpseda. Normaalsetes tingimustes on inimese erütrotsüütide produktsioon väga madal, kuid stressi korral, nagu verejooks, hemolüüs ja hüpoksia, võib erütrotsüütide produktsiooni kiirust suurendada kuni kaheksa korda. Selles protsessis on erütropoetiin EPO üks olulisemaid tegureid.
EPO on peamiselt neerudes sünteesitav hormoon. Selle keemiline olemus on väga glükosüülitud valk. Miks neerudes? Neerude kaudu voolab iga minut umbes liiter verd, nii et nad suudavad kiiresti ja tõhusalt tuvastada muutusi vere hapnikusisalduses. Kui hapnikutase veres on madal, reageerivad neerud kiiresti ja toodavad suures koguses EPO-d. Viimane ringleb vereringe kaudu luuüdi, kus see soodustab erütroidi eellasrakkude muutumist punasteks verelibledeks. Küpsed punased verelibled vabanevad luuüdist vereringesüsteemi, et parandada organismi hapnikuga seondumise võimet. Kui neerud tajuvad vere hapnikusisalduse suurenemist, vähendavad nad EPO tootmist, mis omakorda vähendab punaste vereliblede hulka luuüdis.
See loob täiusliku reguleerimisaasa. Kuid kõrgel kõrgusel elavad inimesed ja mõned aneemiaga patsiendid kogevad sageli pidevalt madala vere hapnikusisalduse seisundit, mis ei suuda ülaltoodud vereringet lõpule viia ja stimuleerida neerusid pidevalt EPO-d eritama, nii et EPO kontsentratsioon veres on kõrgem kui tavalistel inimestel.
Selle paljastamiseks kulus ligi 80 aastat
Nagu paljud suured avastused, ei ole ka teadlaste arusaam EPOst kulgenud sujuvalt ning selle käigus on tekkinud küsimusi ja väljakutseid. EPO kontseptsioonist kuni konkreetse molekuli lõpliku määramiseni kulus ligi 80 aastat.
1906. aastal süstisid Prantsuse teadlased Carnot ja Deflandre normaalsetele küülikutele aneemiliste küülikute seerumit ja leidsid, et punaste vereliblede arv normaalsete küülikute plasmas suureneb. Nad uskusid, et mõned plasma humoraalsed tegurid võivad stimuleerida ja reguleerida punaste vereliblede tootmist. See oli esimene EPO kontseptsiooni prototüüp. Kahjuks ei ole tulemusi järgmistel aastakümnetel korratud, peamiselt seetõttu, et uute punaste vereliblede arv ei olnud täpne.
Reissmanni ja Ruhenstroth-Baueri parabioosikatse 1950. aastal andis tõeliselt tugevaid tõendeid. Nad ühendasid kirurgiliselt kahe elava roti vereringesüsteemid, asetades ühe hüpoksilisse keskkonda ja teise hingates normaalset õhku. Selle tulemusena tootsid mõlemad hiired tohutul hulgal punaseid vereliblesid. Pole kahtlust, et vereringes on punaste vereliblede tootmist stimuleeriv hormoon, millest EPO on saanud oma nime. Teisest küljest on EPO hüpoksia suhtes väga tundlik.
Mis molekul on EPO? Ameerika teadlasel Goldwasseril kulus 30 aastat, et probleem lõpuks biokeemilisel tasandil selgeks teha. Kui tööline tahab teha head tööd, peab ta esmalt teritama oma tööriistu. EPO ülesanne on uute punaste vereliblede stimuleerimine, kuidviimaste arv ei ole täpne. Punaste vereliblede kõige olulisem funktsionaalne molekul on hemoglobiini sisaldav heem, mille keskmes on raua ioon. Nii märgistas Goldwasseri meeskond vastsündinud punaseid vereliblesid radioaktiivsete raua isotoopidega ja töötas välja tundliku meetodi EPO aktiivsuse tuvastamiseks. See võimaldab eraldada ja puhastada väga madala kontsentratsiooniga EPO-d (nanogramme milliliitri kohta) loomsetest vedelikuproovidest. Kuid EPO isoleerimine oli äärmiselt raske. Nad läksid neerude asemel üle aneemilisele lambaplasmale, konksussinfektsioonist tingitud raske rauapuudusega patsientide uriinile ja lõpuks puhastasid 1977. aastal 8 milligrammi inimese EPO valku 2550 liitrist aplastilise aneemiaga Jaapani patsientide uriinist.
1985. aastal viidi lõpule inimese EPO valkude järjestamine ja geenide kloonimine. EPO geen kodeerib 193 aminohappejäägiga polüpeptiidi, mis muutub 166 aminohappejäägist koosnevaks küpseks valguks pärast signaalpeptiidi lõikamist sekretsiooni käigus ja sisaldab 4 saiti glükosüülimise modifitseerimiseks. 1998. aastal analüüsiti EPO NMR lahuse struktuuri ning EPO ja selle retseptorkompleksi kristallstruktuuri. Sel hetkel on inimestel EPOst kõige intuitiivsem arusaam.
Seni nõudis aneemia ravi tavaliselt vereülekannet, et täita punaste vereliblede puudust. Kuna inimesed saavad EPO kohta rohkem teada, on selle süstimine nende enda luuüdis punaste vereliblede tootmise stimuleerimiseks muutnud probleemi lihtsamaks. Kuid EPO puhastamine otse kehavedelikest, nagu seda tegi Goldwasser, on keeruline ja saagikus madal. EPO valgu ja geenijärjestuse määramine võimaldas toota inimese rekombinantset EPO-d suurtes kogustes.
Seda tegi biotehnoloogiaettevõte nimega Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen asutati 1980. aastal vaid seitsme liikmega, lootes toota biofarmatseutilisi preparaate tol ajal esilekerkivate molekulaarbioloogia tehnikate abil. Interferoon, kasvuhormooni vabastav faktor, B-hepatiidi vaktsiin, epidermise kasvufaktor olid nende sihtmärkide nimekirjas populaarsete nimede hulgas, kuid ükski neist katsetest ei õnnestunud. Kuni 1985. aastani kloonis Hiinast Taiwanist pärit Hiina teadlane Lin Fukun inimese EPO geeni ja realiseeris seejärel DNA rekombinatsioonitehnoloogia abil sünteetilise EPO tootmise.
Inimese rekombinantsel EPO-l on sama järjestus kui endogeensel EPO-valgul ja sellel on ka sarnane glükosüülimise modifikatsioon. Loomulikult on inimese rekombinantsel EPO-l ka endogeense EPO aktiivsus. 1989. aasta juunis kiitis USA FDA heaks Amgeni esimese toote, inimese rekombinantse erütropoetiin Epogen, kroonilisest neerupuudulikkusest põhjustatud aneemia ja HIV-nakkuse ravis esineva aneemia raviks. Epogeni müük ületas vaid kolme kuuga 16 miljonit dollarit. Järgmise kahe aastakümne jooksul domineeris Amgen uuesti kokkupandud EPO turul. Epogen tõi Amgenile ainuüksi 2010. aastal 2,5 miljardit dollarit tulu. 2018. aastal oli Amgeni aktsiaturu väärtus 128,8 miljardit dollarit, mis teeb sellest maailma suuruselt kaheksanda ravimifirma.
Väärib märkimist, et Amgen töötas alguses koos Goldwasseriga, et varustada sekveneerimiseks puhastatud inimese EPO valke, kuid Goldwasser ja Amgen läksid ideoloogiliste erinevuste tõttu peagi välja. Goldwasser ja tema Chicago Ülikool, kes tegi alusuuringuid, ei mõelnud kunagi avastatud hormooni patentida ja seega pole nad saanud EPO tohutu äriedu eest sentigi.
See - kuidas see stimulant on
Kui me hingame, siseneb hapnik rakkude mitokondritesse, et juhtida hingamisahelat ja toota tohutul hulgal ATP-d, mis on meie keha peamine energiaallikas. Aneemilistel inimestel ei ole piisavalt terveid punaseid vereliblesid ja kõige vahetum mõju on see, et nad ei võta piisavalt hapnikku, mistõttu nad tunnevad end väsinuna, sarnaselt pika jooksu hingamisprobleemidega. Inimese rekombinantse EPO süstimisel toodavad aneemiaga patsientide kehad rohkem punaseid vereliblesid,kannavad rohkem hapnikku ja toodavad rohkem energiamolekuli ATP-d, leevendades tõhusalt sümptomeid.
Mõned sporditöötajad on aga hakanud mõtlema ka inimese rekombinantsele EPO-le. Kui kasutada EPO-tüüpi kunstlikku rekombinantset hormooni, et stimuleerida sportlaste keha tootma rohkem punaseid vereliblesid, on võimalik parandada sportlaste võimet hankida hapnikku ja toota energiamolekule, mis võib samuti parandada sportlaste sooritusvõimet vastupidavuse alal. üritused, nagu jalgrattasõit, pikamaajooks ja murdmaasuusatamine. 1980. aastal ajakirjas Journal of Applied Physiology avaldatud artikkel näitas, et vere stimulandid (erütropoetiin, kunstlikud hapnikukandjad ja vereülekanded) võivad suurendada vastupidavust 34 protsenti. Kui sportlased kasutavad EPO-d, suudavad nad jooksulindil läbida 8 kilomeetrit senisest 44 sekundiga lühema ajaga. Tegelikult on rattasõit ja maratonid olnud EPO stimulantide kõige hullemad rikkujad. 1998. aasta Tour de France'i ajal arreteeriti Prantsusmaa piiril Festina meeskonna Hispaania meeskonna arst 400 pudeliga kunstliku rekombinantse EPO-ga! Tulemuseks oli muidugi see, et kogu meeskond visati Tourist välja ja sai võistluskeelu.
Rahvusvaheline Olümpiakomitee lisas EPO oma keelatud nimekirja 1992. aasta Barcelona mängudel, kuid inimeste EPO-testide ümberkorraldamine oli nii keeruline, et enne 2000. aasta mänge ei olnud võimalik tõhusalt tuvastada, kas sportlased seda kasutasid. Põhjuseid on mitu: 1) EPO sisaldus kehavedelikes on väga madal ja normaalsetel inimestel on EPO 1 ml veres umbes 130-230 nanogrammi; 2) Kunstliku rekombinantse EPO aminohappeline koostis on täpselt sama, mis inimese endogeense EPO valgu omal, ainult glükosüülimise vorm on väga veidi erinev; 3) EPO poolväärtusaeg veres on ainult 5-6 tundi ja see on üldiselt tuvastamatu 4-7 päeva pärast viimast süsti; 4) Individuaalne EPO tase on väga erinev, mistõttu on raske kehtestada absoluutset kvantitatiivset standardit.
Alates 2000. aastast on WADA kasutanud uriinianalüüsi ainsa teadusliku kontrollimeetodina rekombinantse EPO otseseks tuvastamiseks. Kuna kunstliku rekombinantse EPO ja inimese EPO glükoüülitud vormi vahel on väikesed erinevused, on kahe molekuli laetud omadused väga väikesed ja neid saab eristada elektroforeesi meetodil, mida nimetatakse isoelektriliseks fokuseerimiseks, mis on peamine strateegia kunstliku rekombinantse EPO otsene tuvastamine. Kuid mõned inimesest pärinevate rakkude poolt ekspresseeritud rekombinantsed EPO-d ei näidanud glükosüülimises erinevust, mistõttu mõned eksperdid soovitasid, et eksogeenset EPO-d ja endogeenset EPO-d tuleks eristada erineva süsiniku isotoopide sisalduse järgi.
Tegelikult on erinevatel EPO testimismeetoditel endiselt piiranguid. Näiteks Ameerika rattalegend Lance Armstrong tunnistas, et võttis oma seitsme Tour de France'i võidu ajal EPO-d ja muid stimulante, kuid tegelikult ei kinnitatud toona üheski dopinguproovis EPO positiivset tulemust. Peame veel ootama ja vaatama, kas see on "üks jalg kõrgem" või "üks jalg kõrgem".
Kuidas see Nobeli preemiat teenib
Viimane sõna EPO ja 2019. aasta Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhinna seose kohta.
EPO on inimkeha kõige tüüpilisem hüpoksia tajumise ja reageerimise juhtum. Seetõttu valisid Semenza ja Ratcliffe, kaks Nobeli preemia laureaati, EPO lähtepunktiks, et uurida raku tajumise ja hüpoksiaga kohanemise mehhanismi. Esimene samm oli leida EPO geeni elemendid, mis võiksid reageerida hapniku muutustele. Semenza tuvastas 256-aluselise mittekodeeriva võtmejärjestuse EPO-d kodeeriva geeni 3' allavoolu otsas, mida nimetatakse hüpoksia vastuse elemendiks. Kui see elementide järjestus on muteerunud või kustutatud, väheneb oluliselt EPO valgu võime reageerida hüpoksiale. Kui see elemendijärjestus on liidetud teiste hüpoksiaga mitteseotud geenide allavoolu 3' otsaga, näitavad need modifitseeritud geenid ka EPO-sarnast aktivatsioonihüpoksia tingimustes.
Ratcliffe ja tema meeskond avastasid seejärel, et see hüpoksilise vastuse element ei esine mitte ainult EPO tootmise eest vastutavates neeru- või maksarakkudes, vaid ka paljudes teistes rakutüüpides, mis võivad hüpoksilistes tingimustes toimida. Teisisõnu, see reaktsioon hüpoksiale ei pruugi olla spetsiifiline EPO-le, vaid pigem rakkudes laiemalt levinud nähtus. Need teised rakud, mis ei vastuta EPO tootmise eest, peavad sisaldama molekule (nt geeniekspressiooni sisselülitamise eest vastutavad transkriptsioonifaktorid), mis tajuvad hapniku kontsentratsiooni muutusi ja seostuvad hüpoksiliste reaktsioonielementidega, et lülitada sisse geenid, nagu EPO.
