2019ko Fisiologiako edo Medikuntzako Nobel Sariaren hiru irabazleek, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza eta Sir Peter J. Ratcliffe-k, dagoeneko irabazi zuten 2016ko Oinarrizko Medikuntzako Lasker Saria zelulak nola sumatzen eta moldatzen ziren lanagatik. hipoxiara, beraz, ez zen bereziki harrigarria izan. Hipoxia-induzigarria den 1. faktorea (HIF-1) molekula gakoa aurkitu eta identifikatu zuten. Gaur ikerketaren jatorrira itzuli nahi dugu, hau da, eritropoietina edo EPO, molekula miragarria.
Globulu gorriak sortzeko faktore garrantzitsuena da
Globulu gorriak odoleko zelula mota ugarienak dira, eta oxigenoa eta karbono dioxidoa ornodunen odolean zehar garraiatzeko bitarteko nagusia dira. Eritrozitoak hezur-muinean sortzen dira: zelula am hematopoietikoak lehenik ugaltzen dira eta hainbat odol-zelulen aitzindarietan bereizten dira, eta eritroideen progenitoreak gehiago desberdindu eta eritrozitoetan heldu daitezke. Baldintza normaletan, giza eritrozitoen ekoizpen-tasa oso baxua da, baina odoljarioa, hemolisia eta hipoxia bezalako estresaren ondorioz, eritrozitoen ekoizpen-tasa zortzi aldiz handitu daiteke. Prozesu honetan, eritropoietina EPO faktore garrantzitsuenetako bat da.
EPO batez ere giltzurrunetan sintetizatutako hormona da. Bere izaera kimikoa proteina oso glikosilatua da. Zergatik giltzurrunetan? Minutu bakoitzean litro bat inguru odol isurtzen da giltzurrunetatik, eta, beraz, odoleko oxigeno-mailen aldaketak azkar eta eraginkortasunez hauteman ditzakete. Odolean oxigeno maila baxua denean, giltzurrunek azkar erantzuten dute eta EPO kantitate handiak sortzen dituzte. Azken honek odoletik hezur-muinera zirkulatzen du, non zelula progenitor eritroideak globulu gorri bihurtzea sustatzen baitu. Globulu gorri helduak hezur-muinetik zirkulazio-sistemara askatzen dira, gorputzak oxigenoari lotzeko duen gaitasuna hobetzeko. Giltzurrunek odolean oxigenoaren igoera sumatzen dutenean, EPO ekoizpena murrizten dute, eta horrek hezur-muineko globulu gorrien kopurua murrizten du.
Horrek doikuntza perfektua egiten du. Hala ere, altuera handian bizi diren pertsonek eta anemia gaixo batzuek odoleko oxigeno-maila etengabe baxuaren egoerarekin topo egiten dute, eta horrek ezin du goiko zirkulazioa osatu eta giltzurruna etengabe EPO jaria dezan estimulatzen du, beraz, odoleko EPO kontzentrazioa jende arrunta baino handiagoa da.
Ia 80 urte behar izan zituen agerian jartzeko
Aurkikuntza garrantzitsu asko bezala, zientzialariek EPOaren ulermena ez da erraza izan, bidean galderak eta erronkak sortuz. Ia 80 urte igaro ziren EPO kontzeptutik molekula zehatzaren behin betiko zehaztapenera arte.
1906an, Carnot eta Deflandre zientzialari frantsesek untxi normalak untxi anemikoen serumarekin injektatu zituzten eta untxi normalen plasman globulu gorrien kopurua handitu zela ikusi zuten. Plasmako faktore humoral batzuek globulu gorrien ekoizpena estimulatu eta erregulatu dezaketela uste zuten. Hau izan zen EPO kontzeptuaren lehen prototipoa. Zoritxarrez, emaitzak ez dira ondorengo hamarkadetan errepikatu, batez ere globulu gorri berrien zenbaketa zehatza ez zelako.
1950ean Reissmann eta Ruhenstroth-Bauer-en parabiosi esperimentuak froga oso sendoak eman zituen. Bi arratoi bizidunen zirkulazio-sistema kirurgikoki lotu zituzten, bata ingurune hipoxiko batean jarriz eta bestea aire normala arnasten. Ondorioz, bi saguek globulu gorri kopuru handiak sortu zituzten. Zalantzarik gabe, odol-zirkulazioan globulu gorrien ekoizpena sustatzen duen hormona bat dago, eta hortik datorkio EPO izena. Bestalde, EPO oso sentikorra da hipoxiarekiko.
Zein molekula da EPO? Goldwasser zientzialari estatubatuarrak 30 urte behar izan zituen azkenean arazoa maila biokimikoan argitzeko. Langile batek lan ona egin nahi badu, lehenik tresnak zorroztu behar ditu. EPOaren funtzioa globulu gorri berriak estimulatzea da, bainaazken honen zenbaketa ez da zehatza. Globulu gorrietako molekula funtzional garrantzitsuena hemoa duen hemoglobina da, zeinak ioi ferroso bat dauka bere erdian. Beraz, Goldwasser-en taldeak globulu gorriak jaioberriak burdin isotopo erradioaktiboekin etiketatu zituen eta EPOren jarduera detektatzeko metodo sentikorra garatu zuen. Horri esker, animalien fluidoen laginetatik EPOren (nanogramo bakoitzeko) kontzentrazio oso baxuak isolatu eta araztu daitezke. Baina EPOren isolamendua oso zaila zen. Giltzurrunetik ardi-plasma anemikora pasatu ziren, anemia-zizarearen infekzioaren ondorioz burdin eskasia larria zuten gaixoen gernura, eta, azkenik, 1977an, 2.550 litro gernutik 8 miligramo giza EPO proteina araztu zituzten anemia aplastikoa zuten japoniar pazienteetatik.
1985ean, giza EPOaren proteinen sekuentziazioa eta geneen klonazioa amaitu ziren. EPO geneak 193 amino-hondakin dituen polipeptido bat kodetzen du, 166 aminoazido-hondarrez osatutako proteina heldua bihurtzen da jariatzean seinale-peptidoa moztu ondoren, eta glikosilazioa aldatzeko 4 gune ditu. 1998an, EPOaren NMR disoluzio-egitura eta EPO-ren kristal-egitura eta haren hartzaile-konplexua aztertu ziren. Une honetan, jendeak EPOaren ulermen intuitiboena du.
Orain arte, anemia tratatzeko normalean odol-transfusioak behar ziren globulu gorrien gabezia osatzeko. Jendeak EPOari buruz gehiago ikasten duen heinean, hezur-muinean globulu gorrien ekoizpena suspertzeko injektatzeak arazoa erraztu du. Baina EPO zuzenean gorputz-fluidoetatik araztzea, Goldwasser-ek egin zuen bezala, zaila da eta etekinak baxuak dira. EPO proteina eta gene-sekuentzia zehazteak ahalbidetu zuen giza EPO birkonbinatzailea kantitate handietan ekoiztea.
Applied Molecular Genetics (Amgen) izeneko bioteknologia konpainia batek egin zuen. Amgen 1980an sortu zen zazpi kiderekin soilik, orduan sortzen ari ziren biologia molekularreko teknikekin biofarmakoak egiteko asmoz. Interferoia, hazkuntza hormona askatzen duen faktorea, B hepatitisaren txertoa, hazkuntza epidermikoaren faktorea ziren helburuen zerrendako izen beroen artean, baina saiakera horietako batek ere ez zuen lortu. 1985era arte, Lin Fukun, Taiwango, Txinako zientzialari txinatarrak, giza EPOaren genea klonatu zuen, eta orduan konturatu zen EPO sintetikoa ekoizteaz DNA birkonbinazio teknologia erabiliz.
Giza EPO birkonbinatzaileak EPO proteina endogenoaren sekuentzia bera du, eta antzeko glikosilazio-aldaketa ere badu. Berez, giza EPO birkonbinatzaileak EPO endogenoaren jarduera ere badu. 1989ko ekainean, Amgen-en lehen produktua, giza eritropoietina birkonbinatzailea Epogen, AEBetako FDAk onartu zuen giltzurrun-gutxiegitasun kronikoak eta anemia GIBaren tratamenduan eragindako anemia tratatzeko. Epogen salmentak 16 milioi dolar gainditu zituen hiru hilabetetan. Hurrengo bi hamarkadetan, Amgenek giza EPO birmuntatuaren merkatuan nagusitu zen. Epogenek 2.500 milioi dolar irabazi zituen Amgen-i 2010ean bakarrik. 2018an, Amgen-en burtsaren balioa 128.800 milioi dolar izan zen, eta munduko zortzigarren farmazia-konpainia izan zen.
Azpimarratzekoa da Amgenek hasieran Goldwasserrekin lan egin zuela sekuentziaziorako giza EPO proteina araztuak emateko, baina Goldwasser eta Amgen laster erori ziren desberdintasun ideologikoengatik. Goldwasser-ek eta bere Chicagoko Unibertsitateak, oinarrizko ikerketak egin zituena, ez zuten inoiz pentsatu aurkitu zuen hormona patentatzea, eta, beraz, ez dute zentimorik jaso EPOren arrakasta komertzial itzelagatik.
Nola da estimulatzailea
Arnasa hartzen dugunean, oxigenoa zelulen mitokondrietan sartzen da arnas katea gidatzeko eta ATP kantitate handiak sortzeko, gure gorputzeko energia iturri nagusia. Anemikoek ez dute globulu gorri osasuntsu nahikorik, eta ondoriorik berehalakoena oxigeno nahikoa ez hartzea da, eta horrek nekatuta sentiarazten du, epe luzean arnasketa arazoen antzera. Giza EPO birkonbinatzailea injektatzen denean, anemia gaixoen gorputzek globulu gorri gehiago sortzen dituzte,oxigeno gehiago eramaten dute eta ATP molekula energetiko gehiago ekoizten dute, sintomak eraginkortasunez arinduz.
Hala ere, kirol-langile batzuk giza EPO birkonbinatzailean pentsatzen ere hasi dira. EPO motako hormona birkonbinatzaile artifiziala erabiltzen bada kirolarien gorputza estimulatzeko globulu gorri gehiago ekoizteko, posible da kirolarien oxigenoa lortzeko eta energia molekulak ekoizteko duten gaitasuna hobetzea, eta horrek kirolarien erresistentzian errendimendua hobetu dezake. txirrindularitza, iraupen luzeko lasterketak eta iraupen eskia bezalako ekitaldiak. Journal of Applied Physiology aldizkarian 1980ko artikulu batek erakutsi zuen odol-pizgarriek (eritropoietina, oxigeno-eramaile artifizialak eta odol-transfusioak) erresistentzia ehuneko 34 handitu dezaketela. Kirolariek EPOa erabiltzen badute, 8 kilometro egin ditzakete zinta gainean lehen baino 44 segundo denbora gutxiagoan. Izan ere, txirrindularitza eta maratoiak izan dira EPO pizgarrien kaltegarrienak. 1998ko Frantziako Tourrean, Festina taldeko Espainiako taldeko mediku bat atxilotu zuten Frantziako mugan 400 EPO birkonbinatzaile artifizialarekin! Ondorioz, noski, talde osoa Tourretik kanporatu eta debekatu egin zuten.
Nazioarteko Olinpiar Batzordeak 1992ko Bartzelonako Jokoetan debekatutako zerrendan sartu zuen EPOa, baina giza EPO probak berrantolatzea hain zen zaila, non 2000ko Jokoen aurretik ez zegoen modu eraginkorrean kirolariek erabiltzen zuten ala ez antzemateko. Hainbat arrazoi daude: 1) Gorputzeko fluidoetan EPO edukia oso baxua da, eta pertsona normaletan odol ml bakoitzeko EPO 130-230 nanogramo ingurukoa da; 2) EPO birkonbinatzaile artifizialaren aminoazidoen konposizioa giza EPO proteina endogenoaren berdina da, glikosilazio forma bakarrik apur bat desberdina da; 3) EPOaren erdi-bizitza odolean 5-6 ordukoa baino ez da, eta, oro har, azken injekziotik 4-7 egun igaro ondoren detektaezina da; 4) Banakako EPO maila oso desberdina da, beraz, zaila da estandar kuantitatibo absolutua ezartzea.
2000. urtetik, WADAk gernu-probak erabiltzen ditu egiaztapen zientifikoko metodo bakarra gisa EPO birkonbinatzailea zuzenean detektatzeko. EPO birkonbinatzaile artifizialaren forma glikoilatuaren eta giza EPOaren arteko desberdintasun txikiak direla eta, bi molekulen propietate kargatuak oso txikiak dira eta fokatze isoelektriko deritzon elektroforesi metodo baten bidez bereiz daitezke, hori baita estrategia nagusia. EPO birkonbinatzaile artifizialaren detekzio zuzena. Hala ere, giza eratorritako zelulek adierazitako EPO birkonbinatzaile batzuek ez zuten glikosilazioan desberdintasunik erakutsi, beraz, aditu batzuek iradoki zuten EPO exogenoa eta EPO endogenoa karbono isotopo-eduki ezberdinengatik bereiztea.
Izan ere, oraindik mugak daude EPOrako proba metodo desberdinetan. Esaterako, Lance Armstrong, txirrindularitzaren kondaira estatubatuarrak, EPO eta beste bizigarri batzuk hartu zituela onartu zuen Frantziako Tourreko zazpi garaipenetan, baina ez zuten EPOrako positiborik baieztatu orduko inongo dopin probatan. Oraindik itxaron egin behar dugu "oin bat gorago" ala "oin bat gorago" dagoen.
Nola egiten da Nobel Saria
Azken hitza EPOaren eta 2019ko Fisiologiako edo Medikuntzako Nobel Sariaren arteko loturari buruz.
EPO giza gorputzaren hipoxiaren pertzepzioaren eta erantzunaren kasurik tipikoena da. Horregatik, Semenza eta Ratcliffe Nobel saridun bik EPO aukeratu zuten abiapuntu zelulen pertzepzioaren eta hipoxiarekiko egokitzapenaren mekanismoa aztertzeko. Lehenengo urratsa oxigeno aldaketei erantzuteko moduko EPO genearen elementuak aurkitzea izan zen. Semenzak 256 oinarri kodetzen ez duen sekuentzia giltzarri bat identifikatu zuen EPO kodetzen duen genearen 3 'behean dagoen muturrean, hipoxia erantzunaren elementua izenekoa. Elementu-sekuentzia hori mutatzen edo ezabatzen bada, EPO proteinak hipoxiari erantzuteko duen gaitasuna asko murrizten da. Elementu-sekuentzia hau hipoxiarekin lotuta ez dauden beste gene batzuen 3' amaieran fusionatzen bada, eraldatutako gene hauek EPO antzeko aktibazioa ere erakusten dute.hipoxia baldintzetan.
Ratcliffek eta bere taldeak aurkitu zuten erantzun hipoxikoko elementu hori ez dagoela EPOaren ekoizpenaz arduratzen diren giltzurruneko edo gibeleko zeluletan bakarrik, baizik eta baldintza hipoxikoetan funtziona dezaketen beste zelula mota askotan ere. Beste era batera esanda, hipoxiaren erantzun hori baliteke EPOaren espezifikoa ez izatea, zeluletan hedatuago dagoen fenomenoa baizik. EPO ekoizpenaz arduratzen ez diren beste zelula hauek molekulak izan behar dituzte (esaterako, geneen adierazpena pizteko ardura duten transkripzio-faktoreak) oxigeno-kontzentrazioan aldaketak sumatzen dituzten eta erantzun hipoxikoko elementuekin lotzen diren EPO bezalako geneak pizteko.
