سه برنده جایزه نوبل فیزیولوژی و پزشکی 2019، ویلیام جی. کایلین، جونیور، گرگ ال سمنزا و سر پیتر جی. به هیپوکسی، بنابراین خیلی تعجب آور نبود. آنها مولکول کلیدی عامل القاء کننده هیپوکسی 1 (HIF-1) را کشف و شناسایی کردند. امروز می خواهیم به منشا مطالعه برگردیم که اریتروپویتین یا EPO است، یک مولکول معجزه آسا.

این مهم ترین عامل در تولید گلبول های قرمز خون است

گلبول‌های قرمز فراوان‌ترین نوع سلول‌های خونی در خون هستند و واسطه اصلی برای انتقال اکسیژن و دی اکسید کربن از طریق خون مهره‌داران هستند. گلبول‌های قرمز در مغز استخوان تولید می‌شوند: سلول‌های بنیادی خونساز ابتدا تکثیر می‌شوند و به اجداد سلول‌های خونی مختلف تمایز می‌یابند، و پیش‌سازهای اریتروییدی می‌توانند بیشتر تمایز یافته و به گلبول‌های قرمز بالغ شوند. در شرایط عادی، میزان تولید گلبول های قرمز انسان بسیار کم است، اما تحت استرس هایی مانند خونریزی، همولیز و هیپوکسی، میزان تولید گلبول های قرمز را می توان تا هشت برابر افزایش داد. در این فرآیند اریتروپویتین EPO یکی از مهمترین عوامل است.

EPO هورمونی است که عمدتاً در کلیه سنتز می شود. ماهیت شیمیایی آن یک پروتئین بسیار گلیکوزیله است. چرا در کلیه ها؟ در هر دقیقه حدود یک لیتر خون از کلیه ها جریان می یابد، بنابراین آنها می توانند به سرعت و به طور موثر تغییرات سطح اکسیژن خون را تشخیص دهند. هنگامی که سطح اکسیژن در خون پایین است، کلیه ها به سرعت پاسخ می دهند و مقادیر زیادی EPO تولید می کنند. دومی از طریق جریان خون به مغز استخوان می‌چرخد، جایی که تبدیل سلول‌های پیش‌ساز اریتروئید به گلبول‌های قرمز را افزایش می‌دهد. گلبول های قرمز بالغ از مغز استخوان به سیستم گردش خون آزاد می شوند تا توانایی بدن برای اتصال به اکسیژن را بهبود بخشند. هنگامی که کلیه ها افزایش اکسیژن در خون را احساس می کنند، تولید EPO را کاهش می دهند که به نوبه خود باعث کاهش میزان گلبول های قرمز خون در مغز استخوان می شود.

این یک حلقه تنظیم کامل ایجاد می کند. با این حال، افرادی که در ارتفاعات زندگی می کنند و برخی از بیماران کم خونی اغلب با وضعیت سطح پایین اکسیژن خون به طور مداوم مواجه می شوند، که نمی تواند گردش خون فوق را کامل کند و کلیه را تحریک به ترشح مداوم EPO می کند، به طوری که غلظت EPO خون بالاتر از افراد عادی است.

کشف آن نزدیک به 80 سال طول کشید

مانند بسیاری از اکتشافات مهم، درک دانشمندان از EPO با پرسش‌ها و چالش‌هایی در طول مسیر همراه نبوده است. از مفهوم EPO تا تعیین نهایی مولکول خاص نزدیک به 80 سال طول کشید.

در سال 1906، دانشمندان فرانسوی Carnot و Deflandre، سرم خرگوش‌های کم خون را به خرگوش‌های معمولی تزریق کردند و دریافتند که تعداد گلبول‌های قرمز خون در پلاسمای خرگوش‌های عادی افزایش می‌یابد. آنها معتقد بودند که برخی از عوامل هومورال در پلاسما می توانند تولید گلبول های قرمز خون را تحریک و تنظیم کنند. این اولین نمونه اولیه مفهومی EPO بود. متأسفانه، نتایج در دهه‌های بعدی تکرار نشد، عمدتاً به این دلیل که شمارش گلبول‌های قرمز جدید دقیق نبود.

آزمایش پارابیوز رایسمن و روهنستروت بائر در سال 1950 شواهد بسیار قوی ارائه کرد. آنها با جراحی سیستم گردش خون دو موش زنده را به هم متصل کردند و یکی را در یک محیط هیپوکسیک قرار دادند و دیگری هوای عادی را تنفس کرد. در نتیجه، هر دو موش مقادیر زیادی گلبول قرمز تولید کردند. شکی نیست که هورمونی در جریان خون وجود دارد که تولید گلبول های قرمز را تحریک می کند که نام EPO از آن گرفته شده است. از طرف دیگر، EPO به هیپوکسی بسیار حساس است.

EPO چه مولکولی است؟ دانشمند آمریکایی گلدواسر 30 سال طول کشید تا سرانجام مشکل را در سطح بیوشیمیایی روشن کند. اگر کارگری بخواهد کارش را خوب انجام دهد، اول باید ابزارش را تیز کند. عملکرد EPO تحریک گلبول های قرمز جدید است، اماشمارش دومی دقیق نیست. مهم ترین مولکول عملکردی در گلبول های قرمز، هموگلوبین حاوی هِم است که حاوی یون آهن در مرکز آن است. بنابراین تیم گلدواسر گلبول‌های قرمز خون نوزادان را با ایزوتوپ‌های آهن رادیواکتیو برچسب‌گذاری کردند و روشی حساس برای تشخیص فعالیت EPO ایجاد کردند. این امکان جداسازی و خالص سازی غلظت های بسیار پایین EPO (نانوگرم در میلی لیتر) را از نمونه های مایع حیوانی فراهم می کند. اما جداسازی EPO بسیار دشوار بود. آنها از پلاسمای کلیه به گوسفند کم خون، به ادرار بیماران مبتلا به کمبود شدید آهن به دلیل عفونت کرم قلابدار تغییر دادند و سرانجام در سال 1977، 8 میلی گرم پروتئین EPO انسانی را از 2550 لیتر ادرار بیماران ژاپنی مبتلا به کم خونی آپلاستیک خالص کردند.

در سال 1985، توالی یابی پروتئین و شبیه سازی ژن EPO انسانی کامل شد. ژن EPO یک پلی پپتید با 193 باقیمانده آمینو را کد می کند، که پس از بریده شدن پپتید سیگنال در حین ترشح، به پروتئین بالغ متشکل از 166 باقی مانده اسید آمینه تبدیل می شود و حاوی 4 مکان برای اصلاح گلیکوزیلاسیون است. در سال 1998، ساختار محلول NMR EPO و ساختار کریستالی EPO و مجتمع گیرنده آن مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. در این مرحله، مردم شهودی ترین درک را از EPO دارند.

تا به حال، درمان کم خونی معمولاً نیاز به تزریق خون برای جبران کمبود گلبول های قرمز داشت. همانطور که مردم بیشتر در مورد EPO یاد می گیرند، تزریق آن برای تحریک تولید گلبول قرمز در مغز استخوان خود مشکل را آسان تر کرده است. اما تصفیه EPO به طور مستقیم از مایعات بدن، همانطور که گلدواسر انجام داد، دشوار است و بازده پایین است. تعیین پروتئین EPO و توالی ژن، تولید EPO انسانی نوترکیب را در مقادیر زیاد ممکن کرد.

این کار توسط یک شرکت بیوتکنولوژی به نام Applied Molecular Genetics (Amgen) انجام شد. Amgen در سال 1980 با تنها 7 عضو تاسیس شد و امیدوار بود که داروی زیستی را با تکنیک های نوظهور زیست شناسی مولکولی تولید کند. اینترفرون، فاکتور آزادکننده هورمون رشد، واکسن هپاتیت B، فاکتور رشد اپیدرمی از جمله نام‌های داغ در فهرست اهداف آنها بودند، اما هیچ یک از این تلاش‌ها موفق نشدند. تا سال 1985، لین فوکون، دانشمند چینی از تایوان، چین، ژن EPO انسانی را شبیه سازی کرد و سپس تولید EPO مصنوعی را با استفاده از فناوری نوترکیبی DNA متوجه شد.

EPO انسان نوترکیب دارای توالی مشابه پروتئین EPO درون زا است و همچنین دارای اصلاح گلیکوزیلاسیون مشابه است. به طور طبیعی، EPO نوترکیب انسانی نیز دارای فعالیت EPO درون زا است. در ژوئن 1989، اولین محصول Amgen، اریتروپویتین انسانی نوترکیب Epogen، توسط FDA ایالات متحده برای درمان کم خونی ناشی از نارسایی مزمن کلیه و کم خونی در درمان عفونت HIV تایید شد. فروش Epogen تنها در سه ماه به بیش از 16 میلیون دلار رسید. در طول دو دهه بعد، Amgen بر بازار EPO انسانی سرهم شده تسلط داشت. Epogen تنها در سال 2010 2.5 میلیارد دلار درآمد برای Amgen به ارمغان آورد. در سال 2018، ارزش سهام آمگن در بازار 128.8 میلیارد دلار بود که آن را به هشتمین شرکت بزرگ داروسازی در جهان تبدیل کرد.

شایان ذکر است که Amgen در ابتدا با Goldwasser برای تهیه پروتئین های EPO خالص انسانی برای تعیین توالی کار کرد، اما گلدواسر و Amgen به زودی به دلیل تفاوت های ایدئولوژیک از هم جدا شدند. گلدواسر و دانشگاه شیکاگو او که تحقیقات پایه ای انجام دادند، هرگز فکر نکردند که هورمونی را که او کشف کرده است، ثبت کنند، و بنابراین هیچ پنی برای موفقیت تجاری عظیم EPO دریافت نکرده اند.

این -- چگونه محرک است

وقتی نفس می‌کشیم، اکسیژن وارد میتوکندری سلول‌ها می‌شود تا زنجیره تنفسی را به حرکت درآورد و مقادیر زیادی ATP، منبع اصلی انرژی در بدن ما، تولید کند. افراد کم خون به اندازه کافی گلبول های قرمز سالم ندارند و فوری ترین اثر این است که اکسیژن کافی دریافت نمی کنند که باعث می شود آنها احساس خستگی کنند، مشابه مشکلات تنفسی در یک دوره طولانی. هنگامی که با EPO نوترکیب انسانی تزریق می شود، بدن بیماران کم خونی گلبول های قرمز بیشتری تولید می کند.اکسیژن بیشتری را حمل می کند و مولکول انرژی ATP بیشتری تولید می کند و به طور موثر علائم را تسکین می دهد.

با این حال، برخی از ورزشکاران نیز شروع به فکر کردن به EPO انسانی نوترکیب کرده‌اند. اگر از هورمون نوترکیب مصنوعی از نوع EPO برای تحریک بدن ورزشکاران برای تولید گلبول های قرمز بیشتر استفاده شود، می توان توانایی ورزشکاران در به دست آوردن اکسیژن و تولید مولکول های انرژی را بهبود بخشید که می تواند عملکرد ورزشکاران را در استقامت نیز بهبود بخشد. رویدادهایی مانند دوچرخه سواری، دویدن در مسافت های طولانی و اسکی صحرایی. مقاله ای در سال 1980 در مجله فیزیولوژی کاربردی نشان داد که محرک های خون (اریتروپویتین، حامل های مصنوعی اکسیژن و انتقال خون) می توانند استقامت را تا 34 درصد افزایش دهند. اگر ورزشکاران از EPO استفاده کنند، می توانند 8 کیلومتر را روی تردمیل در 44 ثانیه کمتر از قبل بدود. در واقع، دوچرخه سواری و ماراتن بدترین متخلفان برای محرک های EPO بوده اند. در طول تور دو فرانس 1998، یک پزشک تیم اسپانیایی تیم فستینا در مرز فرانسه با 400 بطری EPO نوترکیب مصنوعی دستگیر شد! نتیجه البته این بود که کل تیم از تور اخراج و محروم شدند.

کمیته بین‌المللی المپیک EPO را در بازی‌های 1992 بارسلونا به فهرست ممنوعه‌های خود اضافه کرد، اما سازماندهی مجدد آزمایش EPO انسانی آنقدر دشوار بود که قبل از بازی‌های 2000 هیچ راهی برای تشخیص مؤثر استفاده ورزشکاران از آن وجود نداشت. دلایل مختلفی وجود دارد: 1) محتوای EPO در مایعات بدن بسیار کم است و EPO در هر میلی لیتر خون در افراد عادی حدود 130-230 نانوگرم است. 2) ترکیب اسید آمینه EPO نوترکیب مصنوعی دقیقاً مشابه پروتئین EPO درون زا انسانی است، فقط شکل گلیکوزیلاسیون بسیار کمی متفاوت است. 3) نیمه عمر EPO در خون تنها 5-6 ساعت است و به طور کلی 4-7 روز پس از آخرین تزریق غیر قابل تشخیص است. 4) سطح EPO فردی بسیار متفاوت است، بنابراین ایجاد یک استاندارد کمی مطلق دشوار است.

از سال 2000، WADA از آزمایش ادرار به عنوان تنها روش تأیید علمی برای تشخیص مستقیم EPO نوترکیب استفاده کرده است. با توجه به تفاوت های جزئی بین شکل گلیکولیله EPO نوترکیب مصنوعی و EPO انسانی، خواص باردار این دو مولکول بسیار ناچیز است و با روش الکتروفورز به نام تمرکز ایزوالکتریک که استراتژی اصلی برای تشخیص مستقیم EPO نوترکیب مصنوعی با این حال، برخی از EPO نوترکیب بیان شده توسط سلول های مشتق از انسان هیچ تفاوتی در گلیکوزیلاسیون نشان ندادند، بنابراین برخی از کارشناسان پیشنهاد کردند که EPO اگزوژن و EPO درون زا باید با محتوای ایزوتوپ کربن متفاوت متمایز شوند.

در واقع، هنوز محدودیت هایی در روش های مختلف تست EPO وجود دارد. به عنوان مثال، لنس آرمسترانگ، اسطوره دوچرخه سواری آمریکا، اعتراف کرد که در طول هفت پیروزی خود در تور دو فرانس، EPO و سایر محرک ها مصرف کرده است، اما در آن زمان در هیچ آزمایش دوپینگ، EPO مثبت اعلام نشد. هنوز باید منتظر ماند و دید که آیا "یک پا بالاتر" است یا "یک پا بالاتر".

چگونه جایزه نوبل می شود

سخن پایانی در مورد ارتباط بین EPO و جایزه نوبل 2019 در فیزیولوژی یا پزشکی.

EPO معمولی ترین مورد درک و پاسخ بدن انسان به هیپوکسی است. بنابراین، سمنزا و رتکلیف، دو برنده جایزه نوبل، EPO را به عنوان نقطه شروع برای مطالعه مکانیسم درک سلول و سازگاری با هیپوکسی انتخاب کردند. اولین قدم یافتن عناصری از ژن EPO بود که بتواند به تغییرات اکسیژن پاسخ دهد. سمنزا یک توالی غیرکدکننده 256 پایه کلیدی را در انتهای 3 'پایین دست ژن کدکننده EPO شناسایی کرد که عنصر پاسخ هیپوکسی نام داشت. اگر این توالی عنصر جهش یافته یا حذف شود، توانایی پروتئین EPO برای پاسخ به هیپوکسی تا حد زیادی کاهش می یابد. اگر این توالی عنصر به پایین دست 3 'انتهای دیگر ژن‌هایی که با هیپوکسی مرتبط نیستند ترکیب شود، این ژن‌های اصلاح‌شده نیز فعال‌سازی شبیه EPO را نشان می‌دهند.تحت شرایط هیپوکسی

سپس رتکلیف و تیمش دریافتند که این عنصر پاسخ هیپوکسیک نه تنها در سلول‌های کلیه یا کبد مسئول تولید EPO وجود دارد، بلکه در بسیاری از انواع سلول‌های دیگر نیز وجود دارد که می‌توانند تحت شرایط هیپوکسیک عمل کنند. به عبارت دیگر، این پاسخ به هیپوکسی ممکن است مختص EPO نباشد، بلکه پدیده ای گسترده تر در سلول ها است. این سلول‌های دیگر، که مسئول تولید EPO نیستند، باید حاوی مولکول‌هایی (مانند فاکتورهای رونویسی مسئول روشن‌کردن بیان ژن) باشند که تغییرات غلظت اکسیژن را حس می‌کنند و به عناصر پاسخ هیپوکسیک متصل می‌شوند تا ژن‌هایی مانند EPO را روشن کنند.