Vuoden 2019 fysiologian tai lääketieteen Nobel-palkinnon kolme voittajaa, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza ja Sir Peter J. Ratcliffe, olivat jo voittaneet vuoden 2016 Lasker-palkinnon peruslääketieteessä työstään solujen havaitsemiseen ja mukautumiseen. hypoksiaan, joten se ei ollut erityisen yllättävää. He löysivät ja tunnistivat avainmolekyylin hypoksialla indusoituvan tekijän 1 (HIF-1). Tänään haluamme palata tutkimuksen alkuperään, joka on erytropoietiini eli EPO, ihmemolekyyli.

Se on tärkein tekijä punasolujen tuotannossa

Punasolut ovat veren runsain verisolutyyppi, ja ne ovat tärkein väliaine hapen ja hiilidioksidin kuljettamiseen selkärankaisten veren läpi. Punasolut syntyvät luuytimessä: Hematopoieettiset kantasolut proliferoituvat ja erilaistuvat erilaisten verisolujen esisoluiksi, ja erytroidiprogenitorit voivat edelleen erilaistua ja kypsyä punasoluiksi. Normaaleissa olosuhteissa ihmisen punasolujen tuotantonopeus on hyvin alhainen, mutta stressin, kuten verenvuodon, hemolyysin ja hypoksian, erytrosyyttien tuotantonopeus voi nousta jopa kahdeksan kertaa. Tässä prosessissa erytropoietiini EPO on yksi tärkeimmistä tekijöistä.

EPO on pääasiassa munuaisissa syntetisoituva hormoni. Sen kemiallinen luonne on erittäin glykosyloitunut proteiini. Miksi munuaisissa? Munuaisten läpi virtaa joka minuutti noin litra verta, joten ne voivat nopeasti ja tehokkaasti havaita muutokset veren happipitoisuuksissa. Kun veren happitaso on alhainen, munuaiset reagoivat nopeasti ja tuottavat suuria määriä EPO:ta. Jälkimmäinen kiertää verenkierron kautta luuytimeen, jossa se edistää erytroidisten progenitorisolujen muuttumista punasoluiksi. Kypsät punasolut vapautuvat luuytimestä verenkiertoelimistöön parantamaan kehon kykyä sitoa happea. Kun munuaiset havaitsevat hapen lisääntymisen veressä, ne vähentävät EPO:n tuotantoa, mikä puolestaan ​​vähentää punasolujen määrää luuytimessä.

Tämä tekee täydellisen säätösilmukan. Korkealla asuvat ihmiset ja jotkut anemiapotilaat kohtaavat kuitenkin usein jatkuvan alhaisen veren happitason, mikä ei voi täydentää yllä olevaa verenkiertoa ja stimuloida munuaista jatkuvasti erittämään EPO:ta, jolloin veren EPO-pitoisuus on korkeampi kuin tavalliset ihmiset.

Sen paljastaminen kesti lähes 80 vuotta

Kuten monet suuret löydöt, tutkijoiden ymmärrys EPO:sta ei ole sujunut sujuvasti, ja matkan varrella on ollut kysymyksiä ja haasteita. EPO:n ideasta tietyn molekyylin lopulliseen määrittämiseen kului lähes 80 vuotta.

Vuonna 1906 ranskalaiset tutkijat Carnot ja Deflandre ruiskuttivat normaaleille kaneille aneemisten kanien seerumia ja havaitsivat, että punasolujen määrä normaalien kaniinien plasmassa nousi. He uskoivat, että jotkut plasman humoraaliset tekijät voivat stimuloida ja säädellä punasolujen tuotantoa. Tämä oli ensimmäinen EPO-konseptin prototyyppi. Valitettavasti tuloksia ei ole toistettu seuraavina vuosikymmeninä, pääasiassa koska uusien punasolujen määrä ei ollut tarkka.

Reissmannin ja Ruhenstroth-Bauerin parabioosikoe vuonna 1950 tarjosi todella vahvan todisteen. He yhdistivät kirurgisesti kahden elävän rotan verenkiertoelimistön asettamalla toisen hypoksiseen ympäristöön ja toisen hengittämään normaalia ilmaa. Tämän seurauksena molemmat hiiret tuottivat valtavia määriä punasoluja. Ei ole epäilystäkään siitä, että verenkierrossa on hormoni, joka stimuloi punasolujen tuotantoa, josta EPO on saanut nimensä. Toisaalta EPO on erittäin herkkä hypoksialle.

Mikä molekyyli on EPO? Amerikkalainen tiedemies Goldwasser kesti 30 vuotta, ennen kuin vihdoin selvitti ongelma biokemiallisella tasolla. Jos työntekijä haluaa tehdä hyvää työtä, hänen on ensin teroitettava työkalunsa. EPO:n tehtävänä on stimuloida uusia punasoluja, muttajälkimmäisten luku ei ole tarkka. Punasolujen tärkein toiminnallinen molekyyli on hemoglobiinia sisältävä hemi, jonka keskellä on rauta-ioni. Joten Goldwasserin tiimi leimaa vastasyntyneiden punasoluja radioaktiivisilla raudan isotoopeilla ja kehitti herkän menetelmän EPO-aktiivisuuden havaitsemiseksi. Tämä mahdollistaa erittäin alhaisten EPO-pitoisuuksien (nanogrammia millilitrassa) eristämisen ja puhdistamisen eläinnestenäytteistä. Mutta EPO:n eristäminen oli erittäin vaikeaa. He siirtyivät munuaisista aneemiseen lampaan plasmaan, sellaisten potilaiden virtsaan, joilla oli vakava raudanpuute koukkumatoinfektion vuoksi, ja lopulta vuonna 1977 puhdistettiin 8 milligrammaa ihmisen EPO-proteiinia 2 550 litrasta japanilaisista aplastisesta anemiasta kärsivien potilaiden virtsasta.

Vuonna 1985 ihmisen EPO:n proteiinisekvensointi ja geenikloonaus saatiin päätökseen. EPO-geeni koodaa polypeptidiä, jossa on 193 aminohappotähdettä, josta tulee kypsä proteiini, joka koostuu 166 aminohappotähteestä sen jälkeen, kun signaalipeptidi on leikattu erityksen aikana, ja joka sisältää 4 kohtaa glykosylaatiomodifikaatiota varten. Vuonna 1998 analysoitiin EPO:n NMR-liuosrakenne sekä EPO:n ja sen reseptorikompleksin kiderakenne. Tässä vaiheessa ihmisillä on intuitiivisin käsitys EPO:sta.

Tähän asti anemian hoito vaati yleensä verensiirtoja punasolujen puutteen korjaamiseksi. Kun ihmiset oppivat lisää EPO:sta, sen injektoiminen punasolujen tuotannon stimuloimiseksi omassa luuytimessä on helpottanut ongelmaa. Mutta EPO:n puhdistaminen suoraan kehon nesteistä, kuten Goldwasser teki, on vaikeaa ja saannot ovat alhaiset. EPO-proteiinin ja geenisekvenssin määrittäminen mahdollisti rekombinantin ihmisen EPO:n valmistamisen suuria määriä.

Sen teki bioteknologiayritys nimeltä Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen perustettiin vuonna 1980, ja siinä on vain seitsemän jäsentä, ja se toivoi voivansa valmistaa biofarmaseuttisia valmisteita molekyylibiologian tuolloin nousevilla tekniikoilla. Interferoni, kasvuhormonia vapauttava tekijä, hepatiitti B -rokote, epidermaalinen kasvutekijä olivat kuumimpia nimiä heidän kohdeluettelossaan, mutta mikään näistä yrityksistä ei onnistunut. Vuoteen 1985 asti Lin Fukun, kiinalainen tiedemies Taiwanista, Kiinasta, kloonasi ihmisen EPO-geenin ja toteutti sitten synteettisen EPO:n tuotannon DNA-rekombinaatioteknologialla.

Rekombinantilla ihmisen EPO:lla on sama sekvenssi kuin endogeenisellä EPO-proteiinilla, ja sillä on myös samanlainen glykosylaatiomodifikaatio. Luonnollisesti rekombinantilla ihmisen EPO:lla on myös endogeenisen EPO:n aktiivisuutta. Kesäkuussa 1989 Amgenin ensimmäinen tuote, rekombinantti ihmisen erytropoietiini Epogen, hyväksyttiin Yhdysvaltain FDA:n toimesta kroonisen munuaisten vajaatoiminnan aiheuttaman anemian ja HIV-infektion hoidossa esiintyvän anemian hoitoon. Epogenin myynti ylitti 16 miljoonaa dollaria vain kolmessa kuukaudessa. Seuraavien kahden vuosikymmenen aikana Amgen hallitsi uudelleen kootun ihmisen EPO:n markkinoita. Epogen toi Amgenille 2,5 miljardia dollaria tuloja pelkästään vuonna 2010. Vuonna 2018 Amgenin osakemarkkina-arvo oli 128,8 miljardia dollaria, mikä tekee siitä maailman kahdeksanneksi suurimman lääkeyhtiön.

On syytä huomata, että Amgen työskenteli alun perin Goldwasserin kanssa tuottaakseen puhdistettuja ihmisen EPO-proteiineja sekvensointia varten, mutta Goldwasser ja Amgen erosivat pian ideologisten erojen vuoksi. Goldwasser ja hänen Chicagon yliopistonsa, joka teki perustutkimusta, eivät koskaan ajatelleet patentoida löytämäänsä hormonia, joten he eivät ole saaneet penniäkään EPO:n valtavasta kaupallisesta menestyksestä.

Se -- miten se on stimulantti

Kun hengitämme, happi tulee solujen mitokondrioihin ohjaamaan hengitysketjua ja tuottamaan valtavia määriä ATP:tä, joka on kehomme tärkein energialähde. Aneemisilla ihmisillä ei ole tarpeeksi terveitä punasoluja, ja välittömin vaikutus on se, että he eivät saa tarpeeksi happea, mikä saa heidät tuntemaan olonsa väsyneeksi, kuten hengitysongelmia pitkän juoksun aikana. Kun anemiapotilaiden kehot tuottavat enemmän punasoluja, kun niille annetaan rekombinanttia ihmisen EPO:ta,kuljettaa enemmän happea ja tuottaa enemmän ATP-energiamolekyyliä, mikä lievittää tehokkaasti oireita.

Jotkut urheilutyöntekijät ovat kuitenkin alkaneet ajatella myös ihmisen rekombinantti-EPO:ta. Jos EPO-tyyppistä keinotekoista rekombinanttihormonia käytetään stimuloimaan urheilijoiden kehoa tuottamaan enemmän punasoluja, on mahdollista parantaa urheilijoiden kykyä saada happea ja tuottaa energiamolekyylejä, mikä voi myös parantaa urheilijoiden suorituskykyä kestävyysalalla. tapahtumia, kuten pyöräilyä, pitkän matkan juoksua ja murtomaahiihtoa. Journal of Applied Physiology -lehdessä vuonna 1980 julkaistu artikkeli osoitti, että veren stimulantit (erytropoietiini, keinotekoiset hapen kantajat ja verensiirrot) voivat lisätä kestävyyttä 34 prosenttia. Jos urheilijat käyttävät EPO:ta, he voivat juosta 8 kilometriä juoksumatolla 44 sekunnissa aiempaa lyhyemmässä ajassa. Itse asiassa pyöräily ja maratonit ovat olleet pahimpia EPO-stimulanttien rikkojia. Vuoden 1998 Tour de Francen aikana Festina-joukkueen espanjalainen joukkueen lääkäri pidätettiin Ranskan rajalla 400 pullolla keinotekoista rekombinantti-EPO:ta! Seurauksena oli tietysti se, että koko joukkue potkittiin Tourilta ja pelikielto.

Kansainvälinen olympiakomitea lisäsi EPO:n kielletylle listalleen vuoden 1992 Barcelonan kisoissa, mutta ihmisten EPO-testien uudelleenjärjestely oli niin vaikeaa, että ennen vuoden 2000 kisoja ei ollut mahdollista havaita tehokkaasti, käyttivätkö urheilijat sitä. Syitä on useita: 1) EPO-pitoisuus kehon nesteissä on hyvin alhainen, ja EPO per ml verta normaalilla ihmisellä on noin 130-230 nanogrammaa; 2) Keinotekoisen rekombinantin EPO:n aminohappokoostumus on täsmälleen sama kuin ihmisen endogeenisen EPO-proteiinin, vain glykosylaation muoto on hyvin vähän erilainen; 3) EPO:n puoliintumisaika veressä on vain 5-6 tuntia, ja sitä ei yleensä voida havaita 4-7 päivää viimeisen injektion jälkeen; 4) Yksittäinen EPO-taso on hyvin erilainen, joten absoluuttista kvantitatiivista standardia on vaikea määrittää.

Vuodesta 2000 lähtien WADA on käyttänyt virtsan testausta ainoana tieteellisenä todentamismenetelmänä rekombinantin EPO:n suorassa havaitsemisessa. Keinotekoisen rekombinantin EPO:n glykoyloidun muodon ja ihmisen EPO:n glykoyloidun muodon välisistä pienistä eroista johtuen näiden kahden molekyylin varautuneet ominaisuudet ovat hyvin pieniä ja ne voidaan erottaa elektroforeesimenetelmällä, jota kutsutaan isoelektriseksi fokusoinniksi, joka on päästrategia keinotekoisen rekombinantin EPO:n suora havaitseminen. Jotkin ihmisperäisten solujen ekspressoimat rekombinantti-EPO eivät kuitenkaan osoittaneet eroa glykosylaatiossa, joten jotkut asiantuntijat ehdottivat, että eksogeeninen EPO ja endogeeninen EPO tulisi erottaa eri hiili-isotooppipitoisuuksista.

Itse asiassa EPO:n eri testausmenetelmissä on edelleen rajoituksia. Esimerkiksi amerikkalainen pyöräilylegenda Lance Armstrong myönsi käyttäneensä EPO:ta ja muita piristeitä seitsemän Tour de France -voittonsa aikana, mutta hänelle ei varsinaisesti vahvistettu EPO-positiivista missään dopingtestissä tuolloin. Meidän on vielä odotettava ja katsottava, onko se "yksi jalka korkeampi" vai "yksi jalka korkeampi".

Miten se tekee Nobel-palkinnon

Viimeinen sana EPO:n ja vuoden 2019 fysiologian tai lääketieteen Nobel-palkinnon välisestä yhteydestä.

EPO on tyypillisin tapaus ihmiskehon havaitsemisesta ja reaktiosta hypoksiaan. Siksi Semenza ja Ratcliffe, kaksi Nobel-palkittua, valitsivat EPO:n lähtökohtana tutkiakseen solujen havainnointimekanismia ja sopeutumista hypoksiaan. Ensimmäinen askel oli löytää EPO-geenin elementit, jotka voisivat reagoida hapen muutoksiin. Semenza tunnisti keskeisen 256 emäksen ei-koodaavan sekvenssin EPO:ta koodaavan geenin 3':n alavirran päässä, nimeltään hypoksiavasteelementti. Jos tämä elementtisekvenssi mutatoidaan tai poistetaan, EPO-proteiinin kyky reagoida hypoksiaan heikkenee suuresti. Jos tämä elementtisekvenssi fuusioidaan muiden geenien alavirran 3'-päähän, jotka eivät liity hypoksiaan, näissä modifioiduissa geeneissä on myös EPO:n kaltainen aktivaatiohypoksia olosuhteissa.

Ratcliffe ja hänen tiiminsä havaitsivat sitten, että tätä hypoksista vasteelementtiä ei ole vain EPO:n tuotannosta vastaavissa munuais- tai maksasoluissa, vaan myös monissa muissa solutyypeissä, jotka voivat toimia hypoksisissa olosuhteissa. Toisin sanoen tämä reaktio hypoksiaan ei ehkä ole spesifinen EPO:lle, vaan pikemminkin soluissa laajempi ilmiö. Näiden muiden solujen, jotka eivät ole vastuussa EPO:n tuotannosta, täytyy sisältää molekyylejä (kuten geeniekspression käynnistämisestä vastaavia transkriptiotekijöitä), jotka havaitsevat muutokset happipitoisuudessa ja sitoutuvat hypoksisiin vasteelementteihin aktivoidakseen geenejä, kuten EPO:ta.