Les trois lauréats du prix Nobel de physiologie ou médecine 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza et Sir Peter J. Ratcliffe avaient déjà remporté le prix Lasker de médecine fondamentale 2016 pour leurs travaux sur la façon dont les cellules détectent et s'adaptent à l'hypoxie, donc ce n'était pas particulièrement surprenant. Ils ont découvert et identifié la molécule clé du facteur 1 inductible par l'hypoxie (HIF-1). Aujourd'hui, nous voulons remonter à l'origine de l'étude, qui est l'érythropoïétine, ou EPO, une molécule miracle.
C'est le facteur le plus important dans la production de globules rouges
Les globules rouges sont le type de cellules sanguines le plus abondant dans le sang et constituent le principal moyen de transport de l'oxygène et du dioxyde de carbone dans le sang des vertébrés. Les érythrocytes sont générés dans la moelle osseuse : les cellules souches hématopoïétiques prolifèrent d'abord et se différencient en progéniteurs de diverses cellules sanguines, et les progéniteurs érythroïdes peuvent ensuite se différencier et mûrir en érythrocytes. Dans des conditions normales, le taux de production d'érythrocytes humains est très faible, mais en cas de stress tel que saignement, hémolyse et hypoxie, le taux de production d'érythrocytes peut être multiplié par huit. Dans ce processus, l'érythropoïétine EPO est l'un des facteurs les plus importants.
L'EPO est une hormone synthétisée principalement dans le rein. Sa nature chimique est une protéine hautement glycosylée. Pourquoi dans les reins ? Environ un litre de sang circule dans les reins chaque minute, ce qui leur permet de détecter rapidement et efficacement les changements de taux d'oxygène dans le sang. Lorsque les niveaux d'oxygène dans le sang sont faibles, les reins réagissent rapidement et produisent de grandes quantités d'EPO. Ce dernier circule dans la circulation sanguine jusqu'à la moelle osseuse, où il favorise la conversion des cellules progénitrices érythroïdes en globules rouges. Les globules rouges matures sont libérés de la moelle osseuse dans le système circulatoire pour améliorer la capacité du corps à se lier à l'oxygène. Lorsque les reins détectent une augmentation de l'oxygène dans le sang, ils réduisent la production d'EPO, ce qui réduit à son tour la quantité de globules rouges dans la moelle osseuse.
Cela fait une boucle de réglage parfaite. Cependant, les personnes vivant à haute altitude et certains patients anémiques rencontrent souvent la condition d'un faible niveau d'oxygène dans le sang, qui ne peut pas compléter la circulation ci-dessus et stimuler le rein à sécréter en continu de l'EPO, de sorte que la concentration d'EPO dans le sang est plus élevée que les gens ordinaires.
Il a fallu près de 80 ans pour le découvrir
Comme pour de nombreuses découvertes majeures, la compréhension de l'EPO par les scientifiques n'a pas été facile, avec des questions et des défis en cours de route. Il a fallu près de 80 ans entre le concept de l'EPO et la détermination finale de la molécule spécifique.
En 1906, les scientifiques français Carnot et Deflandre ont injecté à des lapins normaux le sérum de lapins anémiques et ont découvert que le nombre de globules rouges dans le plasma des lapins normaux augmentait. Ils croyaient que certains facteurs humoraux dans le plasma pouvaient stimuler et réguler la production de globules rouges. Il s'agissait du premier prototype du concept EPO. Malheureusement, les résultats n'ont pas été reproduits au cours des décennies suivantes, principalement parce que le nombre de nouveaux globules rouges n'était pas précis.
L'expérience de parabiose de Reissmann et Ruhenstroth-Bauer en 1950 a fourni des preuves vraiment solides. Ils ont relié chirurgicalement les systèmes circulatoires de deux rats vivants, plaçant l'un dans un environnement hypoxique et l'autre respirant de l'air normal. En conséquence, les deux souris ont produit des quantités massives de globules rouges. Il ne fait aucun doute qu'il existe une hormone dans le sang qui stimule la production de globules rouges, d'où l'EPO tire son nom. En revanche, l'EPO est très sensible à l'hypoxie.
Quelle molécule est l'EPO ? Il a fallu 30 ans au scientifique américain Goldwasser pour enfin clarifier le problème au niveau biochimique. Si un ouvrier veut faire du bon travail, il doit d'abord affûter ses outils. La fonction de l'EPO est de stimuler de nouveaux globules rouges, maisle décompte de ces derniers n'est pas exact. La molécule fonctionnelle la plus importante dans les globules rouges est l'hème contenant de l'hémoglobine, qui contient un ion ferreux en son centre. L'équipe de Goldwasser a donc marqué les globules rouges du nouveau-né avec des isotopes de fer radioactifs et a développé une méthode sensible pour détecter l'activité de l'EPO. Cela permet d'isoler et de purifier de très faibles concentrations d'EPO (nanogrammes par millilitre) à partir d'échantillons de fluides animaux. Mais l'isolement de l'EPO a été extrêmement difficile. Ils sont passés du rein au plasma de mouton anémique, à l'urine de patients souffrant d'une grave carence en fer due à une infection par l'ankylostome, et finalement, en 1977, ils ont purifié 8 milligrammes de protéine EPO humaine à partir de 2 550 litres d'urine de patients japonais atteints d'anémie aplasique.
En 1985, le séquençage des protéines et le clonage des gènes de l'EPO humaine ont été achevés. Le gène EPO code pour un polypeptide de 193 résidus aminés, qui devient une protéine mature composée de 166 résidus d'acides aminés après que le peptide signal a été coupé pendant la sécrétion, et contient 4 sites pour la modification de la glycosylation. En 1998, la structure en solution RMN de l'EPO et la structure cristalline de l'EPO et de son complexe récepteur ont été analysées. À ce stade, les gens ont la compréhension la plus intuitive de l'EPO.
Jusqu'à présent, le traitement de l'anémie nécessitait généralement des transfusions sanguines pour combler le déficit en globules rouges. Au fur et à mesure que les gens en apprennent davantage sur l'EPO, l'injecter pour stimuler la production de globules rouges dans leur propre moelle osseuse a facilité le problème. Mais purifier l'EPO directement à partir des fluides corporels, comme l'a fait Goldwasser, est difficile et les rendements sont faibles. La détermination de la protéine EPO et de la séquence du gène a permis de produire de l'EPO humaine recombinante en grande quantité.
Cela a été fait par une société de biotechnologie appelée Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen a été fondée en 1980 avec seulement sept membres, dans l'espoir de fabriquer des produits biopharmaceutiques avec les techniques alors émergentes de la biologie moléculaire. L'interféron, le facteur de libération de l'hormone de croissance, le vaccin contre l'hépatite B, le facteur de croissance épidermique figuraient parmi les noms brûlants de leur liste de cibles, mais aucune de ces tentatives n'a abouti. Jusqu'en 1985, Lin Fukun, un scientifique chinois de Taiwan, Chine, a cloné le gène de l'EPO humaine, puis a réalisé la production d'EPO synthétique en utilisant la technologie de recombinaison de l'ADN.
L'EPO humaine recombinante a la même séquence que la protéine EPO endogène et a également une modification de glycosylation similaire. Naturellement, l'EPO humaine recombinante a également l'activité de l'EPO endogène. En juin 1989, le premier produit d'Amgen, l'érythropoïétine humaine recombinante Epogen, a été approuvé par la FDA américaine pour le traitement de l'anémie causée par l'insuffisance rénale chronique et l'anémie dans le traitement de l'infection par le VIH. Les ventes d'Epogen ont dépassé les 16 millions de dollars en seulement trois mois. Au cours des deux décennies suivantes, Amgen a dominé le marché de l'EPO humaine réassemblée. Epogen a rapporté à Amgen 2,5 milliards de dollars de revenus rien qu'en 2010. En 2018, la valeur boursière d'Amgen était de 128,8 milliards de dollars, ce qui en fait la huitième plus grande société pharmaceutique au monde.
Il convient de noter qu'Amgen a initialement travaillé avec Goldwasser pour fournir des protéines EPO humaines purifiées pour le séquençage, mais Goldwasser et Amgen se sont rapidement disputés en raison de différences idéologiques. Goldwasser et son université de Chicago, qui ont fait de la recherche fondamentale, n'ont jamais pensé à breveter l'hormone qu'il a découverte, et n'ont donc pas reçu un sou pour l'énorme succès commercial de l'EPO.
C'est - en quoi c'est un stimulant
Lorsque nous respirons, l'oxygène pénètre dans les mitochondries des cellules pour entraîner la chaîne respiratoire et produire des quantités massives d'ATP, la principale source d'énergie de notre corps. Les personnes anémiques n'ont pas assez de globules rouges sains et l'effet le plus immédiat est qu'elles n'absorbent pas assez d'oxygène, ce qui les rend fatiguées, comme des problèmes respiratoires à long terme. Lorsqu'il est injecté avec de l'EPO humaine recombinante, le corps des patients anémiques produit plus de globules rouges,transporter plus d'oxygène et produire plus de la molécule d'énergie ATP, soulageant efficacement les symptômes.
Cependant, certains sportifs ont également commencé à penser à l'EPO humaine recombinante. Si l'hormone recombinante artificielle de type EPO est utilisée pour stimuler le corps des athlètes à produire plus de globules rouges, il est possible d'améliorer la capacité des athlètes à obtenir de l'oxygène et à produire des molécules d'énergie, ce qui peut également améliorer les performances des athlètes en endurance. des événements tels que le cyclisme, la course de fond et le ski de fond. Un article de 1980 dans le Journal of Applied Physiology a montré que les stimulants sanguins (érythropoïétine, transporteurs d'oxygène artificiels et transfusions sanguines) peuvent augmenter l'endurance de 34 %. Si les athlètes utilisent l'EPO, ils peuvent courir 8 kilomètres sur le tapis roulant en 44 secondes de moins qu'auparavant. En fait, le cyclisme et les marathons ont été les pires contrevenants aux stimulants de l'EPO. Lors du Tour de France 1998, un médecin espagnol de l'équipe Festina a été arrêté à la frontière française avec 400 flacons d'EPO recombinante artificielle ! Le résultat, bien sûr, a été que toute l'équipe a été expulsée du Tour et bannie.
Le Comité international olympique a ajouté l'EPO à sa liste d'interdictions lors des Jeux de Barcelone de 1992, mais la réorganisation des tests d'EPO sur l'homme était si difficile qu'avant les Jeux de 2000, il n'y avait aucun moyen de détecter efficacement si les athlètes l'utilisaient. Il y a plusieurs raisons : 1) la teneur en EPO des fluides corporels est très faible et l'EPO par ml de sang chez les personnes normales est d'environ 130 à 230 nanogrammes ; 2) La composition en acides aminés de l'EPO recombinante artificielle est exactement la même que celle de la protéine EPO endogène humaine, seule la forme de glycosylation est très légèrement différente ; 3) La demi-vie de l'EPO dans le sang n'est que de 5 à 6 heures et elle est généralement indétectable 4 à 7 jours après la dernière injection ; 4) Le niveau individuel d'EPO est très différent, il est donc difficile d'établir une norme quantitative absolue.
Depuis 2000, l'AMA utilise les tests d'urine comme seule méthode de vérification scientifique pour la détection directe de l'EPO recombinante. En raison des légères différences entre la forme glycoylée de l'EPO recombinante artificielle et celle de l'EPO humaine, les propriétés chargées des deux molécules sont très faibles et peuvent être distinguées par une méthode d'électrophorèse appelée focalisation isoélectrique, qui est la principale stratégie pour la détection directe de l'EPO recombinante artificielle. Cependant, certaines EPO recombinantes exprimées par des cellules dérivées humaines n'ont montré aucune différence de glycosylation, de sorte que certains experts ont suggéré que l'EPO exogène et l'EPO endogène devraient être distinguées par une teneur différente en isotopes du carbone.
En fait, il existe encore des limitations dans les différentes méthodes de test pour l'EPO. Par exemple, Lance Armstrong, la légende du cyclisme américain, a admis avoir pris de l'EPO et d'autres stimulants lors de ses sept victoires sur le Tour de France, mais il n'a été confirmé positif à l'EPO dans aucun test de dopage à l'époque. Nous devons encore attendre et voir si c'est "un pied plus haut" ou "un pied plus haut".
Comment ça fait un prix Nobel
Un dernier mot sur le lien entre l'EPO et le prix Nobel de physiologie ou médecine 2019.
L'EPO est le cas le plus typique de la perception et de la réponse du corps humain à l'hypoxie. Par conséquent, Semenza et Ratcliffe, deux lauréats du prix Nobel, ont choisi l'EPO comme point de départ pour étudier le mécanisme de perception cellulaire et d'adaptation à l'hypoxie. La première étape consistait à trouver les éléments du gène EPO qui pourraient répondre aux changements d'oxygène. Semenza a identifié une séquence clé non codante de 256 bases à l'extrémité aval 3' du gène codant pour l'EPO, nommée l'élément de réponse à l'hypoxie. Si cette séquence d'éléments est mutée ou délétée, la capacité de la protéine EPO à répondre à l'hypoxie est fortement réduite. Si cette séquence d'éléments est fusionnée à l'extrémité aval 3 'd'autres gènes non associés à l'hypoxie, ces gènes modifiés montrent également une activation de type EPOdans des conditions d'hypoxie.
Ratcliffe et son équipe ont alors découvert que cet élément de réponse hypoxique n'est pas seulement présent dans les cellules rénales ou hépatiques responsables de la production d'EPO, mais aussi dans de nombreux autres types de cellules qui peuvent fonctionner dans des conditions hypoxiques. En d'autres termes, cette réponse à l'hypoxie peut ne pas être spécifique à l'EPO, mais plutôt un phénomène plus répandu dans les cellules. Ces autres cellules, qui ne sont pas responsables de la production d'EPO, doivent contenir des molécules (telles que des facteurs de transcription responsables de l'activation de l'expression génique) qui détectent les changements de concentration en oxygène et se lient aux éléments de réponse hypoxique pour activer des gènes tels que l'EPO.
