De trije winners fan 'e 2019 Nobelpriis foar Fysiology of Genêskunde, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza en Sir Peter J. Ratcliffe hienen al de 2016 Laskerpriis yn Basic Medicine wûn foar har wurk oer hoe't sellen fiele en oanpasse oan hypoxia, dus it wie net bysûnder ferrassend. Se ûntdutsen en identifisearre de kaai molekule hypoxia-inducible faktor 1 (HIF-1). Hjoed wolle wy werom nei de oarsprong fan 'e stúdzje, dat is erythropoietin, of EPO, in wûndermolekule.
It is de wichtichste faktor yn 'e produksje fan reade bloedsellen
Reade bloedsellen binne it meast foarkommende type bloedsellen yn it bloed, en binne it wichtichste medium foar it ferfier fan soerstof en koalstofdiokside troch it bloed fan vertebraten. Erythrozyten wurde generearre yn it bienmurch: Hematopoietyske stamsellen proliferearje earst en differinearje yn foarâlden fan ferskate bloedsellen, en erythroïde foarâlden kinne fierder differinsjearje en reitsje yn erytrocyten. Under normale omstannichheden is de produksje fan erytrocyten fan 'e minske heul leech, mar ûnder stress lykas bloeden, hemolyse en hypoxia kin it taryf fan' e produksje fan erytrocyten oant acht kear ferhege wurde. Yn dit proses is erythropoietin EPO ien fan 'e wichtichste faktoaren.
EPO is in hormoan synthesized benammen yn 'e nieren. Syn gemyske aard is in tige glycosylated proteïne. Wêrom yn 'e nieren? Elke minút streamt sa'n liter bloed troch de nieren, sadat se fluch en effisjint feroaringen yn soerstofnivo's yn it bloed opspoare kinne. As soerstofnivo's yn it bloed leech binne, reagearje de nieren fluch en produsearje grutte hoemannichten EPO. Dy lêste sirkulearret troch de bloedstream nei it bonkenmurg, dêr't it befoarderet de omsetting fan erythroid progenitor sellen yn reade bloedsellen. Mature reade bloedsellen wurde frijlitten út it bonkenmurg yn it sirkulaasjesysteem om it fermogen fan it lichem te ferbetterjen om te binen oan soerstof. As de nieren in ferheging fan soerstof yn it bloed fiele, ferminderje se EPO-produksje, wat op syn beurt de hoemannichte reade bloedsellen yn it bienmurch fermindert.
Dit makket in perfekte oanpassing loop. Lykwols, minsken dy't wenje op hege hichte en guon bloedearmoed pasjinten faak tsjinkomme de betingst fan kontinu leech bloed soerstof nivo, dat kin net foltôgje de boppesteande sirkulaasje en stimulearje de nieren om kontinu secrete EPO, sadat de bloed EPO konsintraasje is heger as gewoane minsken.
It duorre hast 80 jier om it te ûntdekken
Lykas in protte grutte ûntdekkingen, is it begryp fan wittenskippers fan EPO net glêd farren, mei fragen en útdagings ûnderweis. It duorre hast 80 jier fan it konsept fan EPO oant de definitive bepaling fan it spesifike molekule.
Yn 1906, Frânske wittenskippers Carnot en Deflandre ynjeksje normale konijnen mei it serum fan anemyske konijnen en fûnen dat it oantal reade bloedsellen yn it plasma fan normale kninen tanommen. Se leauden dat guon humorale faktoaren yn it plasma de produksje fan reade bloedsellen kinne stimulearje en regelje. Dit wie it earste EPO-konseptprototype. Spitigernôch binne de resultaten yn 'e folgjende desennia net replikearre, benammen om't it oantal nije reade bloedsellen net krekt wie.
Reissmann en Ruhenstroth-Bauer syn parabiosis eksperimint yn 1950 levere echt sterk bewiis. Se keppelen sjirurgysk de sirkulaasjesystemen fan twa libbene rotten, wêrby't de iene yn in hypoksyske omjouwing pleatst en de oare normale lucht ynademt. As gefolch produsearren beide mûzen massive hoemannichten reade bloedsellen. Der is gjin twifel dat der in hormoan yn 'e bloedstream is dat de produksje fan reade bloedsellen stimulearret, wêrfan EPO syn namme kriget. Oan 'e oare kant is EPO heul gefoelich foar hypoxia.
Hokker molekule is EPO? It hat de Amerikaanske wittenskipper Goldwasser 30 jier duorre om it probleem úteinlik op biogemysk nivo te ferdúdlikjen. As in arbeider goed wurk dwaan wol, moat er earst syn ark skerpe. De funksje fan EPO is te stimulearjen nije reade bloedsellen, marde telling fan de lêste is net krekt. De wichtichste funksjonele molekule yn reade bloedsellen is hemoglobine befettet heem, dat befettet in ferro ion yn syn sintrum. Sa markearre it team fan Goldwasser nijberne reade bloedsellen mei radioaktive izeren isotopen en ûntwikkele in gefoelige metoade foar it opspoaren fan EPO-aktiviteit. Dit makket it mooglik om heul lege konsintraasjes fan EPO (nanogram per milliliter) te isolearjen en te suverjen fan monsters fan dierfloeistof. Mar it isolemint fan EPO wie ekstreem lestich. Se gongen oer fan nier nei bloedarmoede skiepplasma, nei de urine fan pasjinten mei in swier izertekoart troch haakwjirmynfeksje, en úteinlik, yn 1977, suvere 8 milligram minsklik EPO-protein út 2.550 liter urine fan Japanske pasjinten mei aplastyske bloedarmoede.
Yn 1985 waarden de proteïne-sekwinsje en gen-kloning fan minsklik EPO foltôge. It EPO-gen kodearret in polypeptide mei 193 amino-residuen, dat in folwoeksen proteïne wurdt gearstald út 166 aminosûrresiduen neidat it sinjaalpeptide is ôfsnien tidens sekretion, en befettet 4 siden foar modifikaasje fan glycosylaasje. Yn 1998 waarden de NMR-oplossingstruktuer fan EPO en de kristalstruktuer fan EPO en har reseptorkompleks analysearre. Op dit punt hawwe minsken it meast yntuïtive begryp fan EPO.
Oant no ta, behanneling foar bloedarmoede meastal nedich bloedtransfúzjes te replenish it tekoart oan reade bloedsellen. As minsken mear leare oer EPO, ynjeksje it om de produksje fan reade bloedsellen yn har eigen bonken te stimulearjen hat it probleem makliker makke. Mar it reinigjen fan EPO direkt fan lichemsfloeistoffen, lykas Goldwasser die, is lestich en de opbringsten binne leech. De bepaling fan EPO-protein en gensekwinsje makke it mooglik om rekombinant minsklik EPO yn grutte hoemannichten te produsearjen.
It waard dien troch in biotechnologybedriuw neamd Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen waard oprjochte yn 1980 mei mar sân leden, yn 'e hope om biofarmaceutika te meitsjen mei de doe-opkommende techniken fan molekulêre biology. Interferon, groei hormoan frijmeitsjende faktor, hepatitis B faksin, epidermal groei faktor wiene ûnder de hjitte nammen op harren list fan doelen, mar gjin fan dizze besykjen slagge. Oant 1985 klonearre Lin Fukun, in Sineeske wittenskipper út Taiwan, Sina, it gen fan minsklik EPO, en realisearre doe de produksje fan syntetyske EPO mei DNA-rekombinaasjetechnology.
Rekombinant minsklik EPO hat deselde folchoarder as endogenous EPO proteïne, en hat ek ferlykbere glycosylation modifikaasje. Natuerlik hat rekombinant minsklik EPO ek de aktiviteit fan endogene EPO. Yn juny 1989 waard Amgen's earste produkt, rekombinant minsklik erythropoietin Epogen, goedkard troch de US FDA foar de behanneling fan bloedarmoede feroarsake troch chronike nierfalen en bloedarmoede yn 'e behanneling fan HIV-ynfeksje. Epogen-ferkeap behelle $ 16 miljoen yn mar trije moannen. Yn 'e kommende twa desennia dominearre Amgen de merk foar opnij gearstald minsklik EPO. Epogen brocht Amgen $ 2,5 miljard yn ynkomsten allinich yn 2010. Yn 2018 wie de oandielmerkwearde fan Amgen $128,8 miljard, wêrtroch it it achtste grutste farmaseutyske bedriuw yn 'e wrâld is.
It is de muoite wurdich opskriuwen dat Amgen yn earste ynstânsje wurke mei Goldwasser te foarsjen suvere minsklike EPO aaiwiten foar sequencing, mar Goldwasser en Amgen gau foelen út fanwege ideologyske ferskillen. Goldwasser en syn Universiteit fan Chicago, dy't basisûndersyk diene, hawwe noait tocht om it hormoan te patintearjen dat hy ûntduts, en hawwe dus gjin penny krigen foar it enoarme kommersjele súkses fan EPO.
It - hoe is it in stimulant
As wy sykhelje, komt soerstof yn 'e mitochondria fan' e sellen om de respiratory chain te riden en massive hoemannichten ATP te produsearjen, de wichtichste boarne fan enerzjy yn ús lichems. Anemyske minsken hawwe net genôch sûne reade bloedsellen, en it meast direkte effekt is dat se net genôch soerstof opnimme, wêrtroch't se har wurch fiele, fergelykber mei sykheljenproblemen yn in lange termyn. By ynjeksje mei rekombinant minsklik EPO produsearje de lichems fan anemia-pasjinten mear reade bloedsellen,drage mear soerstof, en produsearje mear fan de enerzjy molekule ATP, effektyf reliëf symptomen.
Guon sportarbeiders binne lykwols ek begon te tinken oan rekombinant minsklik EPO. As it keunstmjittige rekombinante hormoan fan EPO-type wurdt brûkt om it lichem fan 'e atleten te stimulearjen om mear reade bloedsellen te produsearjen, is it mooglik om it fermogen fan' e atleten te ferbetterjen om soerstof te krijen en enerzjymolekulen te produsearjen, wat ek de prestaasjes fan atleten yn duorsumens kinne ferbetterje eveneminten lykas fytse, lange ôfstannen en langlaufen. In papier út 1980 yn it Journal of Applied Physiology liet sjen dat bloedstimulanten (erythropoietin, keunstmjittige soerstofdragers en bloedtransfúzjes) it úthâldingsfermogen mei 34 prosint ferheegje kinne. As sporters it EPO brûke, kinne se yn 44 sekonden minder tiid 8 kilometer op de loopband drave as earder. Yn feite binne fytsen en maraton de slimste oertreders west foar EPO-stimulanten. Tidens de Tour de France fan 1998 waard in Spaanske teamdokter foar it Festina-team oan 'e Frânske grins arresteare mei 400 flessen keunstmjittich rekombinant EPO! It gefolch wie fansels dat it hiele team út de Tour skopt en ferbean waard.
It Ynternasjonaal Olympysk Komitee foege EPO ta oan syn ferbeane list by de Spullen fan Barcelona fan 1992, mar it reorganisearjen fan minsklike EPO-testen wie sa lestich dat d'r foar de Spullen fan 2000 gjin manier wie om effektyf te ûntdekken oft atleten it brûkten. D'r binne ferskate redenen: 1) EPO-ynhâld yn lichemsfloeistoffen is tige leech, en EPO per ml bloed yn normale minsken is sawat 130-230 nanograms; 2) De amino acid gearstalling fan keunstmjittige rekombinante EPO is krekt itselde as dy fan minsklik endogenous EPO protein, allinnich de foarm fan glycosylation is hiel wat oars; 3) De heale-libben fan EPO yn it bloed is mar 5-6 oeren, en it is algemien undetectable 4-7 dagen nei de lêste ynjeksje; 4) It yndividuele EPO-nivo is hiel oars, dus it is dreech om in absolute kwantitative standert te fêstigjen.
Sûnt 2000 hat WADA urinetesten brûkt as de ienige wittenskiplike ferifikaasjemetoade foar direkte deteksje fan rekombinant EPO. Troch de lichte ferskillen tusken de glycoylearre foarm fan it keunstmjittige rekombinante EPO en dy fan it minsklik EPO, binne de opladen eigenskippen fan de twa molekulen tige lyts en kinne wurde ûnderskieden troch in elektroforesemetoade neamd isoelektrysk fokus, dat is de wichtichste strategy foar de direkte deteksje fan it keunstmjittige rekombinante EPO. Guon rekombinante EPO útdrukt troch minsklike ôflaat sellen lieten lykwols gjin ferskil yn glycosylaasje sjen, sadat guon saakkundigen suggereare dat exogenous EPO en endogenous EPO moatte wurde ûnderskieden troch ferskate koalstofisotoop-ynhâld.
Yn feite binne d'r noch beheiningen yn ferskate testmetoaden foar EPO. Bygelyks, Lance Armstrong, de Amerikaanske hurdfytsleginde, joech ta dat hy EPO en oare stimulâns nommen hie tidens syn sân Tour de France-oerwinningen, mar hy waard op dat stuit net posityf befêstige foar EPO yn in dopingtest. Wy moatte noch ôfwachtsje oft it "ien foet heger" of "ien foet heger" is.
Hoe makket it in Nobelpriis
In lêste wurd oer de ferbining tusken EPO en de 2019 Nobelpriis foar Fysiology of Medicine.
EPO is it meast typyske gefal fan 'e waarnimming fan it minsklik lichem en antwurd op hypoxia. Dêrom keas Semenza en Ratcliffe, twa Nobelpriiswinners, EPO as útgongspunt om it meganisme fan selbelibjen en oanpassing oan hypoxia te studearjen. De earste stap wie om de eleminten fan EPO-gen te finen dy't reagearje kinne op soerstofwizigingen. Semenza identifisearre in kaai 256-base net-kodearjende folchoarder oan de 3 'downstream ein fan it gen kodearjen EPO, neamd de hypoxia antwurd elemint. As dizze elemint folchoarder wurdt mutearre of wiske, it EPO aaiwyt syn fermogen om te reagearjen op hypoxia is sterk fermindere. As dizze elemint folchoarder wurdt fusearre oan de streamôfwerts 3 'ein fan oare genen net assosjearre mei hypoxia, dizze modifisearre genen ek sjen EPO-lykas aktivearringûnder hypoxia betingsten.
Ratcliffe en syn team ûntdutsen doe dat dit hypoksyske reaksje-elemint net allinich oanwêzich is yn 'e nieren of leversellen dy't ferantwurdlik binne foar de produksje fan EPO, mar ek yn in protte oare seltypen dy't kinne funksjonearje ûnder hypoksyske omstannichheden. Mei oare wurden, dizze reaksje op hypoxia kin net spesifyk wêze foar EPO, mar in mear wiidferspraat ferskynsel yn sellen. Dizze oare sellen, dy't net ferantwurdlik binne foar EPO-produksje, moatte molekulen befetsje (lykas transkripsjefaktoaren dy't ferantwurdlik binne foar it ynskeakeljen fan gen-ekspresje) dy't feroaringen yn soerstofkonsintraasje fiele en bine oan hypoksyske reaksje-eleminten om genen lykas EPO yn te skeakeljen.
