Os tres gañadores do Premio Nobel de Fisioloxía ou Medicina 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza e Sir Peter J. Ratcliffe xa gañaran o Premio Lasker de Medicina Básica 2016 polo seu traballo sobre como as células perciben e se adaptan. á hipoxia, polo que non foi especialmente sorprendente. Descubriron e identificaron a molécula clave factor inducible pola hipoxia 1 (HIF-1). Hoxe queremos volver á orixe do estudo, que é a eritropoyetina, ou EPO, unha molécula milagre.

É o factor máis importante na produción de glóbulos vermellos

Os glóbulos vermellos son o tipo máis abundante de células sanguíneas no sangue, e son o principal medio para transportar osíxeno e dióxido de carbono a través do sangue dos vertebrados. Os eritrocitos xéranse na medula ósea: as células nai hematopoyéticas primeiro proliferan e diferéncianse en proxenitores de varias células sanguíneas, e os proxenitores eritroides poden diferenciarse e madurar aínda máis en eritrocitos. En condicións normais, a taxa de produción de eritrocitos humanos é moi baixa, pero baixo estrés como hemorraxia, hemólise e hipoxia, a taxa de produción de eritrocitos pode aumentarse ata oito veces. Neste proceso, a eritropoyetina EPO é un dos factores máis importantes.

A EPO é unha hormona sintetizada principalmente no ril. A súa natureza química é unha proteína altamente glicosilada. Por que nos riles? Ao redor dun litro de sangue flúe polos riles cada minuto, polo que poden detectar de forma rápida e eficiente os cambios nos niveis de osíxeno no sangue. Cando os niveis de osíxeno no sangue son baixos, os riles responden rapidamente e producen grandes cantidades de EPO. Este último circula polo torrente sanguíneo ata a medula ósea, onde favorece a conversión das células proxenitoras eritroides en glóbulos vermellos. Os glóbulos vermellos maduros son liberados da medula ósea ao sistema circulatorio para mellorar a capacidade do corpo de unirse ao osíxeno. Cando os riles detectan un aumento do osíxeno no sangue, reducen a produción de EPO, que á súa vez reduce a cantidade de glóbulos vermellos na medula ósea.

Isto fai un bucle de axuste perfecto. Non obstante, as persoas que viven a gran altitude e algúns pacientes con anemia adoitan atoparse coa condición dun nivel de osíxeno no sangue continuamente baixo, o que non pode completar a circulación anterior e estimular o ril para que segrede continuamente EPO, polo que a concentración de EPO no sangue é maior que a xente común.

Levou case 80 anos descubrilo

Como moitos descubrimentos importantes, a comprensión da EPO por parte dos científicos non foi sen problemas, con preguntas e desafíos ao longo do camiño. Pasaron case 80 anos desde o concepto de EPO ata a determinación final da molécula específica.

En 1906, os científicos franceses Carnot e Deflandre inxectaron a coellos normais o soro de coellos anémicos e descubriron que o reconto de glóbulos vermellos no plasma dos coellos normais aumentaba. Crían que algúns factores humorais do plasma podían estimular e regular a produción de glóbulos vermellos. Este foi o primeiro prototipo de concepto de EPO. Desafortunadamente, os resultados non se reproduciron nas décadas posteriores, principalmente porque o reconto de novos glóbulos vermellos non era preciso.

O experimento de parabiose de Reissmann e Ruhenstroth-Bauer en 1950 proporcionou probas realmente fortes. Conectaron cirurxicamente os sistemas circulatorios de dúas ratas vivas, colocando unha nun ambiente hipóxico e a outra respirando aire normal. Como resultado, ambos ratos produciron cantidades masivas de glóbulos vermellos. Non hai dúbida de que existe unha hormona no torrente sanguíneo que estimula a produción de glóbulos vermellos, da que recibe o nome de EPO. Por outra banda, a EPO é moi sensible á hipoxia.

Que molécula é a EPO? O científico estadounidense Goldwasser tardou 30 anos en aclarar finalmente o problema a nivel bioquímico. Se un traballador quere facer un bo traballo, primeiro debe afiar as súas ferramentas. A función da EPO é estimular novos glóbulos vermellos, peroo reconto destes últimos non é exacto. A molécula funcional máis importante dos glóbulos vermellos é o hemo que contén hemoglobina, que contén un ión ferroso no seu centro. Entón, o equipo de Goldwasser marcou os glóbulos vermellos do recentemente nado con isótopos de ferro radioactivo e desenvolveu un método sensible para detectar a actividade da EPO. Isto fai posible illar e purificar concentracións moi baixas de EPO (nanogramos por mililitro) de mostras de fluídos animais. Pero o illamento da EPO foi extremadamente difícil. Pasaron de plasma de ril a anémico de ovella, a ouriños de pacientes con grave deficiencia de ferro debido á infección por anquilostomas e, finalmente, en 1977, purificaron 8 miligramos de proteína EPO humana de 2.550 litros de ouriños de pacientes xaponeses con anemia aplásica.

En 1985, completouse a secuenciación de proteínas e a clonación de xenes da EPO humana. O xene EPO codifica un polipéptido con 193 residuos amino, que se converte nunha proteína madura composta de 166 residuos de aminoácidos despois de que o péptido sinal é cortado durante a secreción, e contén 4 sitios para a modificación da glicosilación. En 1998, analizouse a estrutura da solución de RMN da EPO e a estrutura cristalina da EPO e o seu complexo receptor. Neste punto, a xente ten a comprensión máis intuitiva da EPO.

Ata agora, o tratamento da anemia adoitaba necesitar transfusións de sangue para repoñer a deficiencia de glóbulos vermellos. A medida que a xente aprende máis sobre a EPO, inxectala para estimular a produción de glóbulos vermellos na súa propia medula ósea facilitou o problema. Pero purificar a EPO directamente dos fluídos corporais, como fixo Goldwasser, é difícil e os rendementos son baixos. A determinación da proteína EPO e da secuencia xenética permitiu producir EPO humana recombinante en grandes cantidades.

Fíxoo unha empresa de biotecnoloxía chamada Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen foi fundada en 1980 con só sete membros, coa esperanza de fabricar produtos biofarmacéuticos coas técnicas daquela emerxentes da bioloxía molecular. O interferón, o factor liberador da hormona de crecemento, a vacina contra a hepatite B e o factor de crecemento epidérmico estaban entre os nomes populares na súa lista de obxectivos, pero ningún destes intentos tivo éxito. Ata 1985, Lin Fukun, un científico chinés de Taiwán, China, clonou o xene da EPO humana, e logo deuse conta da produción de EPO sintética mediante a tecnoloxía de recombinación de ADN.

A EPO humana recombinante ten a mesma secuencia que a proteína EPO endóxena, e tamén ten unha modificación da glicosilación similar. Por suposto, a EPO humana recombinante tamén ten a actividade da EPO endóxena. En xuño de 1989, o primeiro produto de Amgen, a eritropoyetina humana recombinante Epogen, foi aprobado pola FDA dos Estados Unidos para o tratamento da anemia causada pola insuficiencia renal crónica e a anemia no tratamento da infección polo VIH. As vendas de Epogen superaron os 16 millóns de dólares en só tres meses. Durante as dúas décadas seguintes, Amgen dominou o mercado de EPO humano reensamblado. Epogen levou a Amgen 2.500 millóns de dólares en ingresos só en 2010. En 2018, o valor en bolsa de Amgen foi de 128.800 millóns de dólares, o que a converteu na oitava compañía farmacéutica máis grande do mundo.

Cabe sinalar que Amgen traballou inicialmente con Goldwasser para proporcionar proteínas EPO humanas purificadas para a secuenciación, pero Goldwasser e Amgen pronto caeron debido ás diferenzas ideolóxicas. Goldwasser e a súa Universidade de Chicago, que fixeron investigacións básicas, nunca pensaron en patentar a hormona que descubriu, polo que non recibiron nin un centavo polo enorme éxito comercial de EPO.

É - como é un estimulante

Cando respiramos, o osíxeno entra nas mitocondrias das células para impulsar a cadea respiratoria e producir cantidades masivas de ATP, a principal fonte de enerxía do noso corpo. As persoas anémicas non teñen suficientes glóbulos vermellos sans, e o efecto máis inmediato é que non toman o suficiente osíxeno, o que fai que se sintan cansados, de forma similar aos problemas respiratorios durante un longo período. Cando se inxecta con EPO humana recombinante, os corpos dos pacientes con anemia producen máis glóbulos vermellos,transportan máis osíxeno e producen máis da molécula de enerxía ATP, aliviando eficazmente os síntomas.

Non obstante, algúns traballadores do deporte tamén comezaron a pensar na EPO humana recombinante. Se a hormona recombinante artificial de tipo EPO se usa para estimular o corpo dos atletas a producir máis glóbulos vermellos, é posible mellorar a capacidade dos atletas para obter osíxeno e producir moléculas de enerxía, o que tamén pode mellorar o rendemento dos atletas na resistencia. eventos como ciclismo, carreiras de longa distancia e esquí de fondo. Un artigo de 1980 no Journal of Applied Physiology mostrou que os estimulantes sanguíneos (eritropoyetina, transportadores artificiais de osíxeno e transfusións de sangue) poden aumentar a resistencia nun 34 por cento. Se os atletas usan o EPO, poden correr 8 quilómetros na cinta en 44 segundos menos que antes. De feito, o ciclismo e os maratóns foron os peores delincuentes dos estimulantes da EPO. Durante o Tour de Francia de 1998, un médico do equipo español do equipo Festina foi detido na fronteira francesa con 400 botellas de EPO recombinante artificial! O resultado, por suposto, foi que todo o equipo foi expulsado do Tour e sancionado.

O Comité Olímpico Internacional engadiu a EPO á súa lista de prohibidos nos Xogos de Barcelona de 1992, pero reorganizar as probas de EPO en humanos era tan difícil que antes dos Xogos de 2000 non había forma de detectar de forma efectiva se os atletas o estaban a usar. Hai varias razóns: 1) O contido de EPO nos fluídos corporais é moi baixo e a EPO por ml de sangue en persoas normais é duns 130-230 nanogramos; 2) A composición de aminoácidos da EPO recombinante artificial é exactamente a mesma que a da proteína EPO endóxena humana, só a forma de glicosilación é moi lixeiramente diferente; 3) A vida media da EPO no sangue é de só 5-6 horas, e xeralmente é indetectable 4-7 días despois da última inxección; 4) O nivel individual de EPO é moi diferente, polo que é difícil establecer un estándar cuantitativo absoluto.

Desde 2000, a AMA utiliza a proba de ouriños como único método de verificación científica para a detección directa de EPO recombinante. Debido ás pequenas diferenzas entre a forma glicoilada da EPO recombinante artificial e a da EPO humana, as propiedades cargadas das dúas moléculas son moi pequenas e pódense distinguir mediante un método de electroforese denominado enfoque isoeléctrico, que é a principal estratexia para o detección directa de EPO recombinante artificial. Non obstante, algunhas EPO recombinantes expresadas por células derivadas humanas non mostraron diferenzas na glicosilación, polo que algúns expertos suxeriron que a EPO exóxena e a EPO endóxena deberían distinguirse por diferentes contidos de isótopos de carbono.

De feito, aínda hai limitacións nos diferentes métodos de proba para EPO. Por exemplo, Lance Armstrong, a lenda do ciclismo estadounidense, admitiu tomar EPO e outros estimulantes durante as súas sete vitorias no Tour de Francia, pero en realidade non foi confirmado positivo para EPO en ningún test de dopaxe nese momento. Aínda hai que esperar a ver se está "un pé máis alto" ou "un pé máis alto".

Como se fai un premio Nobel

Unha última palabra sobre a conexión entre a EPO e o Premio Nobel de Fisioloxía ou Medicina 2019.

A EPO é o caso máis típico de percepción e resposta do corpo humano á hipoxia. Por iso, Semenza e Ratcliffe, dous premios Nobel, escolleron a EPO como punto de partida para estudar o mecanismo da percepción celular e a adaptación á hipoxia. O primeiro paso foi atopar os elementos do xene EPO que puidesen responder aos cambios de osíxeno. Semenza identificou unha secuencia clave non codificante de 256 bases no extremo 3 'abaixo do xene que codifica a EPO, chamada elemento de resposta á hipoxia. Se esta secuencia de elementos é mutada ou eliminada, a capacidade da proteína EPO para responder á hipoxia redúcese moito. Se esta secuencia de elementos se fusiona co extremo 3' posterior doutros xenes non asociados coa hipoxia, estes xenes modificados tamén mostran unha activación similar á EPO.en condicións de hipoxia.

Ratcliffe e o seu equipo descubriron entón que este elemento de resposta hipóxica non só está presente nas células dos riles ou do fígado responsables da produción de EPO, senón tamén en moitos outros tipos de células que poden funcionar en condicións hipóxicas. Noutras palabras, esta resposta á hipoxia pode non ser específica da EPO, senón un fenómeno máis estendido nas células. Estas outras células, que non son responsables da produción de EPO, deben conter moléculas (como os factores de transcrición responsables de activar a expresión xénica) que detectan os cambios na concentración de osíxeno e se unen a elementos de resposta hipóxica para activar xenes como a EPO.