Trojica dobitnika Nobelove nagrade za fiziologiju ili medicinu 2019., William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza i Sir Peter J. Ratcliffe već su 2016. osvojili nagradu Lasker za osnovnu medicinu za svoj rad na tome kako stanice osjećaju i prilagođavaju se na hipoksiju, tako da nije bilo posebno iznenađenje. Otkrili su i identificirali ključnu molekulu faktor 1 koji izaziva hipoksiju (HIF-1). Danas se želimo vratiti izvoru studije, a to je eritropoetin ili EPO, čudesna molekula.

To je najvažniji čimbenik u proizvodnji crvenih krvnih stanica

Crvena krvna zrnca su najzastupljenija vrsta krvnih zrnaca u krvi i glavni su medij za prijenos kisika i ugljičnog dioksida kroz krv kralješnjaka. Eritrociti nastaju u koštanoj srži: Hematopoetske matične stanice prvo proliferiraju i diferenciraju se u preteče različitih krvnih stanica, a eritroidne preteče mogu se dalje diferencirati i sazrijeti u eritrocite. U normalnim uvjetima, stopa proizvodnje eritrocita kod ljudi je vrlo niska, ali pod stresom poput krvarenja, hemolize i hipoksije, stopa proizvodnje eritrocita može se povećati do osam puta. U tom procesu eritropoetin EPO jedan je od najvažnijih čimbenika.

EPO je hormon koji se uglavnom sintetizira u bubrezima. Njegova kemijska priroda je visoko glikozilirani protein. Zašto u bubrezima? Svake minute kroz bubrege protječe oko litra krvi, tako da oni mogu brzo i učinkovito detektirati promjene razine kisika u krvi. Kada su razine kisika u krvi niske, bubrezi brzo reagiraju i proizvode velike količine EPO. Potonji cirkulira kroz krvotok do koštane srži, gdje potiče pretvorbu eritroidnih progenitorskih stanica u crvene krvne stanice. Zrele crvene krvne stanice otpuštaju se iz koštane srži u krvožilni sustav kako bi se poboljšala sposobnost tijela da se veže za kisik. Kad bubrezi osjete povećanje kisika u krvi, oni smanjuju proizvodnju EPO, što zauzvrat smanjuje količinu crvenih krvnih stanica u koštanoj srži.

Ovo čini savršenu petlju za podešavanje. Međutim, ljudi koji žive na velikoj nadmorskoj visini i neki pacijenti s anemijom često se susreću sa stanjem kontinuirano niske razine kisika u krvi, koja ne može dovršiti gore navedenu cirkulaciju i stimulirati bubrege da kontinuirano luče EPO, tako da je koncentracija EPO u krvi viša nego kod običnih ljudi.

Bilo je potrebno gotovo 80 godina da se to otkrije

Poput mnogih velikih otkrića, znanstveničko razumijevanje EPO-a nije išlo glatko, s pitanjima i izazovima na tom putu. Bilo je potrebno gotovo 80 godina od koncepta EPO do konačnog određivanja specifične molekule.

Godine 1906. francuski znanstvenici Carnot i Deflandre ubrizgali su normalnim kunićima serum anemičnih kunića i otkrili da se broj crvenih krvnih stanica u plazmi normalnih kunića povećao. Vjerovali su da neki humoralni čimbenici u plazmi mogu stimulirati i regulirati proizvodnju crvenih krvnih stanica. Ovo je bio prvi prototip EPO koncepta. Nažalost, rezultati nisu ponovljeni u sljedećim desetljećima, uglavnom zato što broj novih crvenih krvnih stanica nije bio točan.

Pokus s parabiozom Reissmanna i Ruhenstroth-Bauera iz 1950. pružio je stvarno jake dokaze. Kirurški su povezali krvožilni sustav dvaju živih štakora, stavljajući jednog u hipoksičnu okolinu, a drugog udišući normalan zrak. Kao rezultat toga, oba su miša proizvela ogromne količine crvenih krvnih stanica. Nema sumnje da u krvotoku postoji hormon koji potiče stvaranje crvenih krvnih stanica, po čemu je EPO i dobio ime. S druge strane, EPO je vrlo osjetljiv na hipoksiju.

Koja je molekula EPO? Američkom znanstveniku Goldwasseru trebalo je 30 godina da konačno razjasni problem na biokemijskoj razini. Ako radnik želi dobro obaviti posao, prvo mora naoštriti svoj alat. Funkcija EPO je stimulirati nove crvene krvne stanice, alibrojanje potonjeg nije točno. Najvažnija funkcionalna molekula u crvenim krvnim stanicama je hemoglobin koji sadrži hem, koji u svom središtu sadrži željezni ion. Tako je Goldwasserov tim označio crvena krvna zrnca novorođenčeta radioaktivnim izotopima željeza i razvio osjetljivu metodu za otkrivanje aktivnosti EPO. To omogućuje izolaciju i pročišćavanje vrlo niskih koncentracija EPO (nanograma po mililitru) iz uzoraka životinjskih tekućina. Ali izolacija EPO-a bila je iznimno teška. Prešli su s bubrežne na anemičnu ovčju plazmu, na urin pacijenata s teškim nedostatkom željeza zbog infekcije ankilostomazom, i konačno su 1977. pročistili 8 miligrama ljudskog EPO proteina iz 2550 litara urina japanskih pacijenata s aplastičnom anemijom.

Godine 1985. dovršeno je sekvenciranje proteina i kloniranje gena ljudskog EPO. EPO gen kodira polipeptid sa 193 amino ostatka, koji postaje zreli protein sastavljen od 166 aminokiselinskih ostataka nakon što je signalni peptid izrezan tijekom sekrecije, i sadrži 4 mjesta za modifikaciju glikozilacije. Godine 1998. analizirana je NMR struktura otopine EPO i kristalna struktura EPO i njegovog receptorskog kompleksa. U ovom trenutku ljudi imaju najintuitivnije razumijevanje EPO-a.

Do sada je liječenje anemije obično zahtijevalo transfuziju krvi kako bi se nadoknadio nedostatak crvenih krvnih stanica. Kako ljudi uče više o EPO-u, njegovo ubrizgavanje za poticanje proizvodnje crvenih krvnih stanica u vlastitoj koštanoj srži olakšalo je problem. Ali pročišćavanje EPO-a izravno iz tjelesnih tekućina, kao što je učinio Goldwasser, je teško i prinosi su niski. Određivanje EPO proteina i sekvence gena omogućilo je proizvodnju rekombinantnog humanog EPO u velikim količinama.

Učinila je to biotehnološka tvrtka Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen je osnovan 1980. godine sa samo sedam članova, u nadi da će proizvoditi biofarmaceutike s tada nastajućim tehnikama molekularne biologije. Interferon, faktor oslobađanja hormona rasta, cjepivo protiv hepatitisa B, epidermalni faktor rasta bili su među vrućim imenima na njihovom popisu ciljeva, ali nijedan od ovih pokušaja nije uspio. Sve do 1985. Lin Fukun, kineski znanstvenik iz Tajvana, Kina, klonirao je gen ljudskog EPO, a potom realizirao proizvodnju sintetičkog EPO koristeći tehnologiju rekombinacije DNK.

Rekombinantni ljudski EPO ima isti slijed kao endogeni EPO protein, a također ima sličnu modifikaciju glikozilacije. Naravno, rekombinantni ljudski EPO također ima aktivnost endogenog EPO. U lipnju 1989., prvi Amgenov proizvod, rekombinantni humani eritropoetin Epogen, odobrila je američka FDA za liječenje anemije uzrokovane kroničnim zatajenjem bubrega i anemije u liječenju HIV infekcije. Prodaja Epogena premašila je 16 milijuna dolara u samo tri mjeseca. Tijekom sljedeća dva desetljeća Amgen je dominirao tržištem remontovanog ljudskog EPO-a. Epogen je Amgenu samo u 2010. godini donio 2,5 milijardi dolara prihoda. U 2018. Amgenova vrijednost na burzi iznosila je 128,8 milijardi dolara, što ga čini osmom najvećom farmaceutskom kompanijom u svijetu.

Vrijedno je napomenuti da je Amgen u početku radio s Goldwasserom kako bi osigurao pročišćene ljudske EPO proteine ​​za sekvenciranje, ali su se Goldwasser i Amgen ubrzo posvađali zbog ideoloških razlika. Goldwasser i njegovo Sveučilište u Chicagu, koji su proveli temeljna istraživanja, nikada nisu pomislili patentirati hormon koji je on otkrio, pa tako nisu dobili ni penija za veliki komercijalni uspjeh EPO-a.

To -- kako je to stimulans

Kada dišemo, kisik ulazi u mitohondrije stanica kako bi pokrenuo dišni lanac i proizveo ogromne količine ATP-a, glavnog izvora energije u našim tijelima. Anemični ljudi nemaju dovoljno zdravih crvenih krvnih zrnaca, a najizravniji učinak je da ne unose dovoljno kisika, zbog čega se osjećaju umorno, slično problemima s disanjem tijekom dugog trčanja. Kada se ubrizga rekombinantni humani EPO, tijela pacijenata s anemijom proizvode više crvenih krvnih stanica,prenose više kisika i proizvode više energetske molekule ATP, učinkovito ublažavajući simptome.

Međutim, neki sportski djelatnici također su počeli razmišljati o rekombinantnom ljudskom EPO. Ako se umjetni rekombinantni hormon tipa EPO koristi za poticanje tijela sportaša na proizvodnju više crvenih krvnih stanica, moguće je poboljšati sposobnost sportaša za dobivanje kisika i proizvodnju energetskih molekula, što također može poboljšati performanse sportaša u izdržljivosti. događaji kao što su biciklizam, trčanje na duge staze i skijaško trčanje. Rad iz 1980. u časopisu Journal of Applied Physiology pokazao je da stimulansi krvi (eritropoetin, umjetni nosači kisika i transfuzije krvi) mogu povećati izdržljivost za 34 posto. Ako sportaši koriste EPO, mogu istrčati 8 kilometara na traci za 44 sekunde kraće nego prije. Zapravo, biciklizam i maratoni bili su najgori krivci za EPO stimulanse. Tijekom Tour de Francea 1998., liječnik španjolske momčadi Festina uhićen je na francuskoj granici s 400 boca umjetnog rekombinantnog EPO-a! Rezultat je, naravno, bio da je cijeli tim izbačen s Toura i zabranjen.

Međunarodni olimpijski odbor dodao je EPO na svoj popis zabranjenih tvari na Igrama u Barceloni 1992., ali reorganizacija testiranja EPO-a na ljudima bila je toliko teška da prije Igara 2000. nije bilo načina da se učinkovito otkrije koriste li ga sportaši. Postoji nekoliko razloga: 1) sadržaj EPO u tjelesnim tekućinama je vrlo nizak, a EPO po ml krvi u normalnih ljudi je oko 130-230 nanograma; 2) Aminokiselinski sastav umjetnog rekombinantnog EPO potpuno je isti kao i ljudski endogeni EPO protein, samo je oblik glikozilacije vrlo malo drugačiji; 3) Poluživot EPO u krvi je samo 5-6 sati, a općenito se ne može otkriti 4-7 dana nakon zadnje injekcije; 4) Pojedinačna razina EPO vrlo je različita, pa je teško uspostaviti apsolutni kvantitativni standard.

Od 2000. godine WADA koristi testiranje urina kao jedinu znanstvenu metodu provjere za izravnu detekciju rekombinantnog EPO. Zbog malih razlika između glikoiliranog oblika umjetnog rekombinantnog EPO-a i ljudskog EPO-a, svojstva naboja dviju molekula vrlo su mala i mogu se razlikovati metodom elektroforeze koja se zove izoelektrično fokusiranje, što je glavna strategija za izravna detekcija umjetnog rekombinantnog EPO. Međutim, neki rekombinantni EPO izražen u stanicama dobivenim od ljudi nije pokazao razliku u glikozilaciji, pa su neki stručnjaci predložili da se egzogeni EPO i endogeni EPO razlikuju po različitom sadržaju izotopa ugljika.

Zapravo, još uvijek postoje ograničenja u različitim metodama testiranja za EPO. Na primjer, Lance Armstrong, američka biciklistička legenda, priznao je da je uzimao EPO i druge stimulanse tijekom svojih sedam pobjeda na Tour de Franceu, ali zapravo nije potvrđeno da je pozitivan na EPO ni na jednom doping testu u to vrijeme. Moramo još pričekati i vidjeti je li "jedna noga viša" ili "jedna noga viša".

Kako to čini Nobelovu nagradu

Posljednja riječ o vezi između EPO-a i Nobelove nagrade za fiziologiju ili medicinu 2019.

EPO je najtipičniji slučaj percepcije i odgovora ljudskog tijela na hipoksiju. Stoga su Semenza i Ratcliffe, dva nobelovca, odabrali EPO kao polazište za proučavanje mehanizma stanične percepcije i prilagodbe na hipoksiju. Prvi korak bio je pronaći elemente EPO gena koji bi mogli odgovoriti na promjene kisika. Semenza je identificirala ključnu nekodirajuću sekvencu od 256 baza na 3' nizvodnom kraju gena koji kodira EPO, nazvanu element odgovora na hipoksiju. Ako je ovaj slijed elementa mutiran ili izbrisan, sposobnost EPO proteina da odgovori na hipoksiju je znatno smanjena. Ako je ovaj slijed elementa spojen na nizvodni 3' kraj drugih gena koji nisu povezani s hipoksijom, ti modificirani geni također pokazuju aktivaciju sličnu EPO-uu uvjetima hipoksije.

Ratcliffe i njegov tim potom su otkrili da ovaj element odgovora na hipoksiju nije prisutan samo u stanicama bubrega ili jetre odgovornim za proizvodnju EPO-a, već iu mnogim drugim vrstama stanica koje mogu funkcionirati u uvjetima hipoksije. Drugim riječima, ovaj odgovor na hipoksiju možda nije specifičan za EPO, već je rašireniji fenomen u stanicama. Ove druge stanice, koje nisu odgovorne za proizvodnju EPO-a, moraju sadržavati molekule (kao što su faktori transkripcije odgovorni za uključivanje ekspresije gena) koje osjećaju promjene u koncentraciji kisika i vežu se za elemente hipoksičnog odgovora da uključe gene kao što je EPO.