Ֆիզիոլոգիայի կամ բժշկության բնագավառում 2019 թվականի Նոբելյան մրցանակի երեք դափնեկիրները՝ Ուիլյամ Գ. Քեյլինը, կրտսերը, Գրեգ Լ. Սեմենզան և սըր Փիթեր Ջ. դեպի հիպոքսիա, ուստի դա առանձնապես զարմանալի չէր: Նրանք հայտնաբերեցին և հայտնաբերեցին հիպոքսիայի ազդեցությամբ 1-ին (HIF-1) հիմնական մոլեկուլը: Այսօր մենք ուզում ենք վերադառնալ ուսումնասիրության ծագմանը, որն է erythropoietin կամ EPO, հրաշք մոլեկուլ:

Դա կարմիր արյան բջիջների արտադրության ամենակարեւոր գործոնն է

Արյան կարմիր բջիջները արյան մեջ արյան բջիջների ամենաառատ տեսակն են և հանդիսանում են ողնաշարավորների արյան միջոցով թթվածնի և ածխածնի երկօքսիդի տեղափոխման հիմնական միջոցը: Էրիտրոցիտները ստեղծվում են ոսկրածուծում. արյունաստեղծ ցողունային բջիջները սկզբում բազմանում են և տարբերվում են տարբեր արյան բջիջների նախածնողների, իսկ էրիթրոիդ պրոգենիտորները կարող են հետագայում տարբերակվել և հասունանալ էրիթրոցիտների: Նորմալ պայմաններում մարդու էրիթրոցիտների արտադրության արագությունը շատ ցածր է, բայց սթրեսի դեպքում, ինչպիսիք են արյունահոսությունը, հեմոլիզը և հիպոքսիան, էրիթրոցիտների արտադրության արագությունը կարող է աճել մինչև ութ անգամ: Այս գործընթացում erythropoietin EPO-ն ամենակարևոր գործոններից մեկն է:

EPO-ն հորմոն է, որը սինթեզվում է հիմնականում երիկամներում։ Նրա քիմիական բնույթը բարձր գլիկոզիլացված սպիտակուց է: Ինչու՞ երիկամներում: Մոտ մեկ լիտր արյուն է հոսում երիկամներով ամեն րոպե, այնպես որ նրանք կարող են արագ և արդյունավետ կերպով հայտնաբերել արյան մեջ թթվածնի մակարդակի փոփոխությունները: Երբ արյան մեջ թթվածնի մակարդակը ցածր է, երիկամները արագ արձագանքում են և արտադրում մեծ քանակությամբ EPO: Վերջինս արյան միջոցով շրջանառվում է դեպի ոսկրածուծ, որտեղ նպաստում է էրիթրոիդ պրոգենիտոր բջիջների վերածմանը արյան կարմիր բջիջների: Հասուն կարմիր արյան բջիջները ոսկրածուծից ազատվում են շրջանառության համակարգ՝ բարելավելու մարմնի թթվածնի հետ կապվելու ունակությունը: Երբ երիկամները զգում են արյան մեջ թթվածնի ավելացում, նրանք նվազեցնում են EPO արտադրությունը, որն իր հերթին նվազեցնում է ոսկրածուծում կարմիր արյան բջիջների քանակը:

Սա կատարում է կատարյալ ճշգրտման օղակ: Այնուամենայնիվ, բարձր բարձրության վրա ապրող մարդիկ և սակավարյունության որոշ հիվանդներ հաճախ հանդիպում են արյան մեջ թթվածնի անընդհատ ցածր մակարդակի հետ, որը չի կարող ավարտել վերը նշված շրջանառությունը և խթանում է երիկամը շարունակաբար արտազատել EPO, այնպես որ արյան EPO կոնցենտրացիան ավելի բարձր է, քան սովորական մարդկանց:

Այն բացահայտելու համար պահանջվեց մոտ 80 տարի

Ինչպես շատ մեծ հայտնագործություններ, գիտնականների՝ EPO-ի ըմբռնումը հարթ ընթացք չի ունեցել՝ ճանապարհին ունենալով հարցեր և մարտահրավերներ: Մոտ 80 տարի պահանջվեց EPO-ի հայեցակարգից մինչև կոնկրետ մոլեկուլի վերջնական որոշումը:

1906 թվականին ֆրանսիացի գիտնականներ Կարնոն և Դեֆլանդրը նորմալ ճագարներին ներարկեցին անեմիկ նապաստակների շիճուկ և պարզեցին, որ նորմալ ճագարների պլազմայում կարմիր արյան բջիջների քանակը մեծանում է: Նրանք կարծում էին, որ պլազմայի որոշ հումորալ գործոններ կարող են խթանել և կարգավորել կարմիր արյան բջիջների արտադրությունը: Սա EPO կոնցեպտի առաջին նախատիպն էր: Ցավոք, արդյունքները չեն կրկնվել հետագա տասնամյակների ընթացքում, հիմնականում այն ​​պատճառով, որ արյան նոր կարմիր բջիջների հաշվարկը ճշգրիտ չէր:

Ռայսմանի և Ռուենստրոթ-Բաուերի պարաբիոզի փորձը 1950 թվականին իսկապես ուժեղ ապացույցներ տվեց: Նրանք վիրահատական ​​ճանապարհով միացրել են երկու կենդանի առնետների շրջանառության համակարգերը՝ մեկը դնելով հիպոքսիկ միջավայրում, իսկ մյուսը նորմալ օդ է շնչում: Արդյունքում, երկու մկներն էլ արտադրեցին հսկայական քանակությամբ կարմիր արյան բջիջներ: Կասկածից վեր է, որ արյան մեջ կա մի հորմոն, որը խթանում է արյան կարմիր բջիջների արտադրությունը, որից էլ EPO-ն ստացել է իր անվանումը։ Մյուս կողմից, EPO-ն շատ զգայուն է հիպոքսիայի նկատմամբ:

Ի՞նչ մոլեկուլ է EPO-ն: Ամերիկացի գիտնական Գոլդվասերից պահանջվեց 30 տարի, որպեսզի վերջնականապես պարզաբաներ խնդիրը կենսաքիմիական մակարդակով։ Եթե ​​բանվորն ուզում է լավ աշխատանք կատարել, նախ պետք է իր գործիքները սրի։ EPO-ի ֆունկցիան արյան նոր կարմիր բջիջների խթանումն է, բայցվերջիններիս հաշվարկը ճշգրիտ չէ. Կարմիր արյան բջիջների ամենակարևոր ֆունկցիոնալ մոլեկուլը հեմոգլոբին պարունակող հեմն է, որն իր կենտրոնում պարունակում է երկաթի իոն: Այսպիսով, Գոլդվասերի թիմը նորածին արյան կարմիր բջիջները պիտակավորեց ռադիոակտիվ երկաթի իզոտոպներով և մշակեց EPO-ի ակտիվությունը հայտնաբերելու զգայուն մեթոդ: Սա հնարավորություն է տալիս մեկուսացնել և մաքրել EPO-ի շատ ցածր կոնցենտրացիաները (նանոգրամ մեկ միլիլիտրում) կենդանական հեղուկի նմուշներից: Բայց EPO-ի մեկուսացումը չափազանց դժվար էր։ Նրանք երիկամից անցան ոչխարի սակավարյուն պլազմայի, մանգաղի վարակի պատճառով երկաթի խիստ անբավարարություն ունեցող հիվանդների մեզի, և վերջապես 1977 թվականին մաքրեցին 8 միլիգրամ մարդու EPO սպիտակուցը 2550 լիտր մեզից ճապոնացի ապլաստիկ անեմիայով հիվանդներից:

1985 թվականին ավարտվեց մարդու EPO-ի սպիտակուցների հաջորդականությունը և գեների կլոնավորումը: EPO գենը կոդավորում է 193 ամինո մնացորդներով պոլիպեպտիդ, որը դառնում է հասուն սպիտակուց՝ կազմված 166 ամինաթթուների մնացորդներից հետո, երբ ազդանշանային պեպտիդը կտրվում է սեկրեցիայի ընթացքում և պարունակում է 4 տեղ՝ գլիկոզիլացման փոփոխության համար: 1998 թվականին վերլուծվել են EPO-ի NMR լուծույթի կառուցվածքը և EPO-ի բյուրեղային կառուցվածքը և նրա ընկալիչային համալիրը: Այս պահին մարդիկ ամենաինտուիտիվ են հասկանում EPO-ն:

Մինչ այժմ անեմիայի բուժումը սովորաբար պահանջում էր արյան փոխներարկում՝ կարմիր արյան բջիջների պակասը լրացնելու համար։ Քանի որ մարդիկ ավելին են սովորում EPO-ի մասին, այն ներարկելով, որպեսզի խթանեն արյան կարմիր բջիջների արտադրությունը իրենց իսկ ոսկրածուծում, հեշտացրել է խնդիրը: Բայց EPO-ն անմիջապես մարմնի հեղուկներից մաքրելը, ինչպես դա արեց Գոլդվասերը, դժվար է, իսկ բերքատվությունը՝ ցածր: EPO սպիտակուցի և գեների հաջորդականության որոշումը հնարավորություն տվեց մեծ քանակությամբ արտադրել մարդու ռեկոմբինանտ EPO:

Դա արվել է բիոտեխնոլոգիական ընկերության կողմից, որը կոչվում է Applied Molecular Genetics (Amgen): Amgen-ը հիմնադրվել է 1980 թվականին ընդամենը յոթ անդամով՝ հույս ունենալով կենսադեղամիջոցներ արտադրել մոլեկուլային կենսաբանության այն ժամանակ առաջացող տեխնիկայով: Ինտերֆերոնը, աճի հորմոնի ազատման գործոնը, հեպատիտ B-ի դեմ պատվաստանյութը, էպիդերմիսի աճի գործոնը նրանց թիրախների ցանկում ամենահայտնի անուններից էին, բայց այդ փորձերից ոչ մեկը հաջողությամբ չհաջողվեց: Մինչև 1985 թվականը չինացի գիտնական Լին Ֆուկունը Թայվանից, Չինաստանից, կլոնավորեց մարդու EPO-ի գենը, այնուհետև իրականացրեց սինթետիկ EPO-ի արտադրությունը ԴՆԹ-ի վերակոմբինացիայի տեխնոլոգիայի միջոցով:

Մարդու ռեկոմբինանտ EPO-ն ունի նույն հաջորդականությունը, ինչ էնդոգեն EPO սպիտակուցը, ինչպես նաև ունի գլիկոզիլացման նմանատիպ ձևափոխություն: Բնականաբար, ռեկոմբինանտ մարդու EPO-ն ունի նաև էնդոգեն EPO-ի ակտիվություն: 1989 թվականի հունիսին Amgen-ի առաջին արտադրանքը՝ մարդու ռեկոմբինանտ էրիթրոպոետին Էպոգենը, հաստատվել է ԱՄՆ FDA-ի կողմից՝ երիկամային քրոնիկական անբավարարության և սակավարյունության հետևանքով առաջացած անեմիայի բուժման համար ՄԻԱՎ վարակի բուժման ժամանակ: Epogen-ի վաճառքը ընդամենը երեք ամսում գերազանցել է 16 միլիոն դոլարը: Հաջորդ երկու տասնամյակների ընթացքում Amgen-ը գերիշխում էր վերահավաքված մարդկային EPO-ի շուկայում: Միայն 2010 թվականին Epogen-ը Amgen-ին բերել է 2,5 միլիարդ դոլար եկամուտ: 2018 թվականին Amgen-ի արժեթղթերի շուկայական արժեքը կազմել է 128,8 միլիարդ դոլար, ինչը նրան դարձնում է աշխարհի ութերորդ խոշորագույն դեղագործական ընկերությունը:

Հարկ է նշել, որ Amgen-ը սկզբում աշխատել է Goldwasser-ի հետ՝ ապահովելու մաքրված մարդկային EPO սպիտակուցներ հաջորդականության համար, սակայն Goldwasser-ը և Amgen-ը շուտով դուրս են եկել գաղափարական տարբերությունների պատճառով: Գոլդվասերը և նրա Չիկագոյի համալսարանը, որոնք կատարել են հիմնարար հետազոտություններ, երբեք չեն մտածել արտոնագրելու իր հայտնաբերած հորմոնը, և, հետևաբար, ոչ մի կոպեկ չեն ստացել EPO-ի հսկայական առևտրային հաջողության համար:

Դա - ինչպես է դա խթանիչ

Երբ մենք շնչում ենք, թթվածինը ներթափանցում է բջիջների միտոքոնդրիումը՝ մղելու շնչառական շղթան և արտադրելու հսկայական քանակությամբ ATP՝ մեր օրգանիզմի էներգիայի հիմնական աղբյուրը: Անեմիկ մարդիկ չունեն բավականաչափ առողջ կարմիր արյան բջիջներ, և ամենաանմիջական ազդեցությունն այն է, որ նրանք բավարար քանակությամբ թթվածին չեն ընդունում, ինչը ստիպում է նրանց հոգնած զգալ, ինչը նման է երկար վազքի ընթացքում շնչառական խնդիրներին: Երբ ներարկվում է ռեկոմբինանտ մարդու EPO, անեմիայով հիվանդների մարմինները արտադրում են ավելի շատ կարմիր արյան բջիջներ,կրում է ավելի շատ թթվածին և արտադրում է ավելի շատ էներգիայի մոլեկուլ ATP՝ արդյունավետորեն թեթևացնելով ախտանիշները:

Այնուամենայնիվ, որոշ սպորտային աշխատողներ նույնպես սկսել են մտածել ռեկոմբինանտ մարդու EPO-ի մասին: Եթե ​​EPO տեսակի արհեստական ​​ռեկոմբինանտ հորմոնն օգտագործվում է մարզիկների օրգանիզմը ավելի շատ կարմիր արյան բջիջներ արտադրելու համար, ապա հնարավոր է բարելավել մարզիկների՝ թթվածին ստանալու և էներգիայի մոլեկուլներ արտադրելու ունակությունը, ինչը կարող է նաև բարելավել մարզիկների աշխատունակությունը տոկունության մեջ: միջոցառումներ, ինչպիսիք են հեծանվավազքը, միջքաղաքային վազքը և դահուկավազքը: 1980 թվականին Journal of Applied Physiology ամսագրում հրապարակված հոդվածը ցույց տվեց, որ արյան խթանիչները (էրիթրոպոետին, արհեստական ​​թթվածնի կրիչներ և արյան փոխներարկում) կարող են բարձրացնել տոկունությունը 34 տոկոսով: Եթե ​​մարզիկները օգտվում են EPO-ից, նրանք կարող են վազել 8 կիլոմետր վազքուղու վրա 44 վայրկյան ավելի քիչ ժամանակում, քան նախկինում էր: Իրականում, հեծանվավազքն ու մարաթոնները եղել են EPO խթանիչների ամենավատ խախտումները: 1998 թվականի Տուր դե Ֆրանսի ժամանակ Ֆեստինայի թիմի իսպանացի բժիշկը ձերբակալվել է Ֆրանսիայի սահմանին՝ 400 շիշ արհեստական ​​ռեկոմբինանտ EPO-ով: Արդյունքն, իհարկե, եղավ այն, որ ամբողջ թիմը դուրս մղվեց Տուրից և արգելվեց:

Միջազգային օլիմպիական կոմիտեն 1992 թվականին Բարսելոնայի խաղերում EPO-ն ավելացրեց իր արգելված ցուցակում, սակայն մարդկանց EPO թեստավորումը վերակազմավորելը այնքան դժվար էր, որ մինչև 2000 թվականի խաղերը ոչ մի միջոց չկար արդյունավետորեն պարզելու, թե արդյոք մարզիկները օգտագործում էին այն: Կան մի քանի պատճառներ. 1) EPO-ի պարունակությունը մարմնի հեղուկներում շատ ցածր է, իսկ EPO-ն մեկ մլ արյան մեջ նորմալ մարդկանց մոտ կազմում է մոտ 130-230 նանոգրամ; 2) Արհեստական ​​ռեկոմբինանտ EPO-ի ամինաթթուների բաղադրությունը ճիշտ նույնն է, ինչ մարդու էնդոգեն EPO սպիտակուցը, միայն գլիկոզիլացման ձևը շատ փոքր-ինչ տարբեր է. 3) Արյան մեջ EPO-ի կես կյանքը կազմում է ընդամենը 5-6 ժամ, և այն ընդհանուր առմամբ աննկատելի է վերջին ներարկումից 4-7 օր հետո. 4) Անհատական ​​EPO մակարդակը շատ տարբեր է, ուստի դժվար է սահմանել բացարձակ քանակական ստանդարտ:

2000 թվականից WADA-ն օգտագործում է մեզի թեստը՝ որպես ռեկոմբինանտ EPO-ի ուղղակի հայտնաբերման միակ գիտական ​​ստուգման մեթոդ: Արհեստական ​​ռեկոմբինանտ EPO-ի և մարդու EPO-ի գլիկոլացված ձևի աննշան տարբերության պատճառով երկու մոլեկուլների լիցքավորված հատկությունները շատ փոքր են և կարող են տարբերվել էլեկտրոֆորեզի մեթոդով, որը կոչվում է իզոէլեկտրական ֆոկուս, որը հիմնական ռազմավարությունն է: Արհեստական ​​ռեկոմբինանտ EPO-ի ուղղակի հայտնաբերում: Այնուամենայնիվ, որոշ ռեկոմբինանտ EPO, որոնք արտահայտված են մարդու ածանցյալ բջիջներով, տարբերություն չեն ցույց տվել գլիկոզիլացման մեջ, ուստի որոշ փորձագետներ առաջարկել են, որ էկզոգեն EPO-ն և էնդոգեն EPO-ն պետք է տարբերվեն ածխածնի իզոտոպների տարբեր պարունակությամբ:

Փաստորեն, EPO-ի տարբեր փորձարկման մեթոդներում դեռևս կան սահմանափակումներ: Օրինակ՝ Լենս Արմսթրոնգը՝ ամերիկյան հեծանվային սպորտի լեգենդը, խոստովանել է, որ ընդունել է EPO և այլ խթանիչներ Տուր դե Ֆրանսի իր յոթ հաղթանակների ժամանակ, սակայն այն ժամանակ ոչ մի դոպինգ թեստում EPO-ի համար դրական չի հաստատվել: Դեռ պետք է սպասենք ու տեսնենք՝ «մեկ ոտնաչափ բարձր է», թե «մեկ ոտնաչափ բարձր»։

Ինչպե՞ս է դա դառնում Նոբելյան մրցանակ

Վերջնական խոսք EPO-ի և 2019 թվականի ֆիզիոլոգիայի կամ բժշկության Նոբելյան մրցանակի միջև կապի մասին:

EPO-ն մարդու օրգանիզմի հիպոքսիայի ընկալման և արձագանքման ամենատիպիկ դեպքն է: Ուստի Սեմենզան և Ռաթքլիֆը՝ երկու Նոբելյան մրցանակակիրներ, ընտրեցին EPO-ն որպես ելակետ՝ ուսումնասիրելու բջիջների ընկալման և հիպոքսիային հարմարվելու մեխանիզմը։ Առաջին քայլը EPO գենի այն տարրերի հայտնաբերումն էր, որոնք կարող էին արձագանքել թթվածնի փոփոխություններին: Semenza-ն հայտնաբերել է առանցքային 256-բազային ոչ կոդավորող հաջորդականություն EPO կոդավորող գենի 3-րդ վերջում, որը կոչվում է հիպոքսիայի արձագանքման տարր: Եթե ​​այս տարրի հաջորդականությունը մուտացիայի է ենթարկվում կամ ջնջվում է, ապա EPO սպիտակուցի` հիպոքսիային արձագանքելու ունակությունը զգալիորեն նվազում է: Եթե ​​այս տարրի հաջորդականությունը միաձուլվում է հիպոքսիայի հետ չկապակցված այլ գեների ներքևի 3' ծայրին, այս փոփոխված գեները նաև ցույց են տալիս EPO-ի նման ակտիվացում:հիպոքսիայի պայմաններում.

Այնուհետև Ռաթքլիֆը և նրա թիմը հայտնաբերեցին, որ հիպոքսիկ արձագանքման այս տարրը առկա է ոչ միայն երիկամների կամ լյարդի բջիջներում, որոնք պատասխանատու են EPO-ի արտադրության համար, այլև շատ այլ բջիջների տեսակների մեջ, որոնք կարող են գործել հիպոքսիկ պայմաններում: Այլ կերպ ասած, հիպոքսիայի այս արձագանքը կարող է հատուկ լինել ոչ թե EPO-ին, այլ ավելի շատ ավելի տարածված երևույթ բջիջներում: Այս մյուս բջիջները, որոնք պատասխանատու չեն EPO-ի արտադրության համար, պետք է պարունակեն մոլեկուլներ (օրինակ՝ տրանսկրիպցիոն գործոններ, որոնք պատասխանատու են գեների արտահայտման համար), որոնք զգում են թթվածնի կոնցենտրացիայի փոփոխությունները և կապվում են հիպոքսիկ արձագանքման տարրերին՝ միացնելու գեները, ինչպիսիք են EPO-ն: