Tiga pemenang Hadiah Nobel Fisiologi atau Kedokteran 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza, dan Sir Peter J. Ratcliffe telah memenangkan Hadiah Lasker 2016 dalam Kedokteran Dasar atas karya mereka tentang bagaimana sel merasakan dan beradaptasi hipoksia, jadi itu tidak terlalu mengejutkan. Mereka menemukan dan mengidentifikasi molekul kunci faktor yang diinduksi hipoksia 1 (HIF-1). Hari ini kami ingin kembali ke asal penelitian, yaitu erythropoietin, atau EPO, sebuah molekul ajaib.

Ini adalah faktor terpenting dalam produksi sel darah merah

Sel darah merah adalah jenis sel darah yang paling melimpah di dalam darah, dan merupakan media utama untuk mengangkut oksigen dan karbon dioksida melalui darah vertebrata. Eritrosit dihasilkan di sumsum tulang: Sel induk hematopoietik pertama kali berkembang biak dan berdiferensiasi menjadi progenitor berbagai sel darah, dan progenitor eritroid selanjutnya dapat berdiferensiasi dan matang menjadi eritrosit. Dalam kondisi normal, laju produksi eritrosit manusia sangat rendah, tetapi di bawah tekanan seperti perdarahan, hemolisis, dan hipoksia, laju produksi eritrosit dapat meningkat hingga delapan kali lipat. Dalam proses ini, EPO erythropoietin adalah salah satu faktor terpenting.

EPO adalah hormon yang disintesis terutama di ginjal. Sifat kimianya adalah protein yang sangat terglikosilasi. Mengapa di ginjal? Sekitar satu liter darah mengalir melalui ginjal setiap menit, sehingga ginjal dapat dengan cepat dan efisien mendeteksi perubahan kadar oksigen dalam darah. Ketika kadar oksigen dalam darah rendah, ginjal merespons dengan cepat dan menghasilkan EPO dalam jumlah besar. Yang terakhir bersirkulasi melalui aliran darah ke sumsum tulang, di mana ia mendorong konversi sel progenitor eritroid menjadi sel darah merah. Sel darah merah yang matang dilepaskan dari sumsum tulang ke dalam sistem peredaran darah untuk meningkatkan kemampuan tubuh mengikat oksigen. Ketika ginjal merasakan peningkatan oksigen dalam darah, mereka mengurangi produksi EPO, yang pada gilirannya mengurangi jumlah sel darah merah di sumsum tulang.

Ini membuat loop penyesuaian yang sempurna. Namun, orang yang tinggal di dataran tinggi dan beberapa pasien anemia sering mengalami kondisi kadar oksigen darah yang terus menerus rendah, yang tidak dapat menyelesaikan sirkulasi di atas dan merangsang ginjal untuk terus mengeluarkan EPO, sehingga konsentrasi EPO darah lebih tinggi daripada orang biasa.

Butuh waktu hampir 80 tahun untuk mengungkapnya

Seperti banyak penemuan besar, pemahaman para ilmuwan tentang EPO belum berjalan mulus, dengan pertanyaan dan tantangan di sepanjang jalan. Butuh waktu hampir 80 tahun dari konsep EPO hingga penentuan akhir molekul spesifik.

Pada tahun 1906, ilmuwan Prancis Carnot dan Deflandre menyuntikkan kelinci normal dengan serum kelinci anemia dan menemukan bahwa jumlah sel darah merah dalam plasma kelinci normal meningkat. Mereka percaya bahwa beberapa faktor humoral dalam plasma dapat merangsang dan mengatur produksi sel darah merah. Ini adalah prototipe konsep EPO pertama. Sayangnya, hasilnya belum direplikasi dalam beberapa dekade berikutnya, terutama karena jumlah sel darah merah yang baru tidak akurat.

Eksperimen parabiosis Reissmann dan Ruhenstroth-Bauer pada tahun 1950 memberikan bukti yang sangat kuat. Mereka dengan pembedahan menghubungkan sistem peredaran darah dari dua tikus hidup, menempatkan satu di lingkungan hipoksia dan yang lainnya menghirup udara normal. Akibatnya, kedua tikus menghasilkan sel darah merah dalam jumlah besar. Tidak ada keraguan bahwa dalam aliran darah ada hormon yang merangsang produksi sel darah merah, dari mana EPO mendapatkan namanya. Sebaliknya, EPO sangat sensitif terhadap hipoksia.

Molekul apa itu EPO? Ilmuwan Amerika Goldwasser membutuhkan waktu 30 tahun untuk akhirnya mengklarifikasi masalah di tingkat biokimia. Jika seorang pekerja ingin melakukan pekerjaan dengan baik, dia harus mengasah alatnya terlebih dahulu. Fungsi EPO adalah merangsang sel darah merah baru, tetapihitungan yang terakhir tidak akurat. Molekul fungsional terpenting dalam sel darah merah adalah hemoglobin yang mengandung heme, yang mengandung ion besi di tengahnya. Jadi tim Goldwasser memberi label sel darah merah yang baru lahir dengan isotop besi radioaktif dan mengembangkan metode sensitif untuk mendeteksi aktivitas EPO. Hal ini memungkinkan untuk mengisolasi dan memurnikan konsentrasi EPO (nanogram per mililiter) yang sangat rendah dari sampel cairan hewan. Tetapi isolasi EPO sangat sulit. Mereka beralih dari ginjal ke plasma domba yang anemia, ke urin pasien dengan kekurangan zat besi yang parah akibat infeksi cacing tambang, dan akhirnya, pada tahun 1977, memurnikan 8 miligram protein EPO manusia dari 2.550 liter urin dari pasien Jepang dengan anemia aplastik.

Pada tahun 1985, pengurutan protein dan kloning gen EPO manusia selesai. Gen EPO mengkode polipeptida dengan 193 residu amino, yang menjadi protein matang yang terdiri dari 166 residu asam amino setelah peptida sinyal dipotong selama sekresi, dan berisi 4 situs untuk modifikasi glikosilasi. Pada tahun 1998, struktur larutan NMR EPO dan struktur kristal EPO serta kompleks reseptornya dianalisis. Pada titik ini, orang memiliki pemahaman EPO yang paling intuitif.

Sampai saat ini, pengobatan anemia biasanya memerlukan transfusi darah untuk mengisi kembali kekurangan sel darah merah. Ketika orang belajar lebih banyak tentang EPO, menyuntikkannya untuk merangsang produksi sel darah merah di sumsum tulang mereka sendiri telah membuat masalah menjadi lebih mudah. Tetapi memurnikan EPO langsung dari cairan tubuh, seperti yang dilakukan Goldwasser, sulit dan hasilnya rendah. Penentuan protein EPO dan urutan gen memungkinkan untuk menghasilkan EPO manusia rekombinan dalam jumlah besar.

Itu dilakukan oleh perusahaan bioteknologi bernama Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen didirikan pada tahun 1980 dengan hanya tujuh anggota, berharap untuk membuat biofarmasi dengan teknik biologi molekuler yang muncul saat itu. Interferon, faktor pelepas hormon pertumbuhan, vaksin hepatitis B, faktor pertumbuhan epidermal termasuk di antara nama-nama panas dalam daftar target mereka, tetapi tidak satu pun dari upaya ini yang berhasil. Hingga tahun 1985, Lin Fukun, seorang ilmuwan Tiongkok dari Taiwan, Tiongkok, mengkloning gen EPO manusia, dan kemudian merealisasikan produksi EPO sintetik menggunakan teknologi rekombinasi DNA.

EPO manusia rekombinan memiliki urutan yang sama dengan protein EPO endogen, dan juga memiliki modifikasi glikosilasi serupa. Secara alami, EPO manusia rekombinan juga memiliki aktivitas EPO endogen. Pada bulan Juni 1989, produk pertama Amgen, Epogen erythropoietin manusia rekombinan, telah disetujui oleh FDA AS untuk pengobatan anemia yang disebabkan oleh gagal ginjal kronis dan anemia dalam pengobatan infeksi HIV. Penjualan epogen mencapai $16 juta hanya dalam tiga bulan. Selama dua dekade berikutnya, Amgen mendominasi pasar untuk EPO manusia yang dipasang kembali. Epogen menghasilkan pendapatan Amgen $2,5 miliar pada tahun 2010 saja. Pada tahun 2018, nilai pasar saham Amgen adalah $128,8 miliar, menjadikannya perusahaan farmasi terbesar kedelapan di dunia.

Perlu dicatat bahwa Amgen awalnya bekerja dengan Goldwasser untuk menyediakan protein EPO manusia yang dimurnikan untuk pengurutan, tetapi Goldwasser dan Amgen segera berselisih karena perbedaan ideologis. Goldwasser dan University of Chicago miliknya, yang melakukan penelitian dasar, tidak pernah berpikir untuk mematenkan hormon yang dia temukan, sehingga belum menerima sepeser pun untuk kesuksesan komersial EPO yang besar.

Ini -- bagaimana itu sebuah stimulan

Saat kita bernapas, oksigen memasuki mitokondria sel untuk menggerakkan rantai pernapasan dan menghasilkan ATP dalam jumlah besar, sumber energi utama dalam tubuh kita. Orang anemia tidak memiliki cukup sel darah merah yang sehat, dan efek paling cepat adalah mereka tidak mendapatkan oksigen yang cukup, yang membuat mereka merasa lelah, mirip dengan masalah pernapasan dalam jangka panjang. Ketika disuntik dengan EPO manusia rekombinan, tubuh pasien anemia menghasilkan lebih banyak sel darah merah,membawa lebih banyak oksigen, dan menghasilkan lebih banyak molekul energi ATP, secara efektif meredakan gejala.

Namun, beberapa pekerja olahraga juga mulai memikirkan EPO manusia rekombinan. Jika hormon rekombinan buatan jenis EPO digunakan untuk merangsang tubuh atlet untuk memproduksi lebih banyak sel darah merah, dimungkinkan untuk meningkatkan kemampuan atlet untuk mendapatkan oksigen dan menghasilkan molekul energi, yang juga dapat meningkatkan kinerja atlet dalam daya tahan. acara seperti bersepeda, lari jarak jauh dan ski lintas alam. Sebuah makalah tahun 1980 dalam Journal of Applied Physiology menunjukkan bahwa stimulan darah (erythropoietin, pembawa oksigen buatan, dan transfusi darah) dapat meningkatkan daya tahan tubuh hingga 34 persen. Jika atlet menggunakan EPO, mereka dapat berlari sejauh 8 kilometer di atas treadmill dalam waktu 44 detik lebih cepat dari sebelumnya. Faktanya, bersepeda dan maraton adalah pelanggar terburuk untuk stimulan EPO. Selama Tour de France 1998, seorang dokter tim Spanyol untuk tim Festina ditangkap di perbatasan Prancis dengan 400 botol EPO rekombinan buatan! Hasilnya, tentu saja, seluruh tim dikeluarkan dari Tur dan dilarang.

Komite Olimpiade Internasional menambahkan EPO ke daftar larangannya pada Olimpiade Barcelona 1992, tetapi mengatur ulang pengujian EPO pada manusia sangat sulit sehingga sebelum Olimpiade 2000 tidak ada cara untuk secara efektif mendeteksi apakah atlet menggunakannya. Ada beberapa sebab: 1) Kandungan EPO dalam cairan tubuh sangat rendah, dan EPO per ml darah pada orang normal sekitar 130-230 nanogram; 2) Komposisi asam amino EPO rekombinan buatan persis sama dengan komposisi protein EPO endogen manusia, hanya bentuk glikosilasinya yang sedikit berbeda; 3) Waktu paruh EPO dalam darah hanya 5-6 jam, dan umumnya tidak terdeteksi 4-7 hari setelah penyuntikan terakhir; 4) Tingkat EPO individu sangat berbeda, sehingga sulit untuk menetapkan standar kuantitatif absolut.

Sejak tahun 2000, WADA telah menggunakan tes urine sebagai satu-satunya metode verifikasi ilmiah untuk deteksi langsung EPO rekombinan. Karena sedikit perbedaan antara bentuk terglikoilasi dari EPO rekombinan buatan dan EPO manusia, sifat bermuatan dari dua molekul sangat kecil dan dapat dibedakan dengan metode elektroforesis yang disebut pemfokusan isoelektrik, yang merupakan strategi utama untuk deteksi langsung EPO rekombinan buatan. Namun, beberapa EPO rekombinan yang diekspresikan oleh sel turunan manusia tidak menunjukkan perbedaan glikosilasi, sehingga beberapa ahli menyarankan bahwa EPO eksogen dan EPO endogen harus dibedakan berdasarkan kandungan isotop karbon yang berbeda.

Nyatanya, masih ada keterbatasan dalam metode pengujian EPO yang berbeda. Misalnya, Lance Armstrong, legenda bersepeda Amerika, mengaku menggunakan EPO dan stimulan lainnya selama tujuh kemenangannya di Tour de France, tetapi dia sebenarnya tidak dikonfirmasi positif EPO dalam tes doping mana pun saat itu. Kami masih harus menunggu dan melihat apakah itu "satu kaki lebih tinggi" atau "satu kaki lebih tinggi".

Bagaimana itu membuat Hadiah Nobel

Kata terakhir tentang hubungan antara EPO dan Hadiah Nobel Fisiologi atau Kedokteran 2019.

EPO adalah kasus paling umum dari persepsi dan respons tubuh manusia terhadap hipoksia. Oleh karena itu, Semenza dan Ratcliffe, dua peraih Nobel, memilih EPO sebagai titik awal untuk mempelajari mekanisme persepsi dan adaptasi sel terhadap hipoksia. Langkah pertama adalah menemukan elemen gen EPO yang dapat merespon perubahan oksigen. Semenza mengidentifikasi urutan non-coding 256-basis utama di ujung hilir 3 'dari gen yang mengkode EPO, yang disebut elemen respons hipoksia. Jika urutan elemen ini dimutasi atau dihapus, kemampuan protein EPO untuk merespons hipoksia sangat berkurang. Jika urutan elemen ini digabungkan ke ujung hilir 3 'dari gen lain yang tidak terkait dengan hipoksia, gen yang dimodifikasi ini juga menunjukkan aktivasi seperti EPOdalam kondisi hipoksia.

Ratcliffe dan timnya kemudian menemukan bahwa elemen respons hipoksia ini tidak hanya ada di sel ginjal atau hati yang bertanggung jawab untuk produksi EPO, tetapi juga di banyak jenis sel lain yang dapat berfungsi dalam kondisi hipoksia. Dengan kata lain, respons terhadap hipoksia ini mungkin tidak spesifik untuk EPO, melainkan fenomena yang lebih luas di dalam sel. Sel-sel lain ini, yang tidak bertanggung jawab untuk produksi EPO, harus mengandung molekul (seperti faktor transkripsi yang bertanggung jawab untuk mengaktifkan ekspresi gen) yang merasakan perubahan konsentrasi oksigen dan mengikat elemen respons hipoksia untuk mengaktifkan gen seperti EPO.