I tre vincitori del Premio Nobel 2019 per la Fisiologia o la Medicina, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza e Sir Peter J. Ratcliffe avevano già vinto il Premio Lasker 2016 per la Medicina di base per il loro lavoro su come le cellule percepiscono e si adattano all'ipossia, quindi non era particolarmente sorprendente. Hanno scoperto e identificato la molecola chiave fattore 1 inducibile dall'ipossia (HIF-1). Oggi vogliamo tornare all'origine dello studio, che è l'eritropoietina, o EPO, una molecola miracolosa.
È il fattore più importante nella produzione di globuli rossi
I globuli rossi sono il tipo più abbondante di cellule del sangue nel sangue e sono il mezzo principale per il trasporto di ossigeno e anidride carbonica attraverso il sangue dei vertebrati. Gli eritrociti sono generati nel midollo osseo: le cellule staminali ematopoietiche prima proliferano e si differenziano in progenitori di varie cellule del sangue, e i progenitori eritroidi possono ulteriormente differenziarsi e maturare in eritrociti. In condizioni normali, il tasso di produzione di eritrociti umani è molto basso, ma sotto stress come sanguinamento, emolisi e ipossia, il tasso di produzione di eritrociti può essere aumentato fino a otto volte. In questo processo, l'eritropoietina EPO è uno dei fattori più importanti.
L'EPO è un ormone sintetizzato principalmente nel rene. La sua natura chimica è una proteina altamente glicosilata. Perché nei reni? Circa un litro di sangue scorre attraverso i reni ogni minuto, in modo che possano rilevare in modo rapido ed efficiente i cambiamenti nei livelli di ossigeno nel sangue. Quando i livelli di ossigeno nel sangue sono bassi, i reni rispondono rapidamente e producono grandi quantità di EPO. Quest'ultimo circola attraverso il flusso sanguigno fino al midollo osseo, dove promuove la conversione delle cellule progenitrici eritroidi in globuli rossi. I globuli rossi maturi vengono rilasciati dal midollo osseo nel sistema circolatorio per migliorare la capacità del corpo di legarsi all'ossigeno. Quando i reni avvertono un aumento di ossigeno nel sangue, riducono la produzione di EPO, che a sua volta riduce la quantità di globuli rossi nel midollo osseo.
Questo crea un anello di regolazione perfetto. Tuttavia, le persone che vivono in alta quota e alcuni pazienti affetti da anemia incontrano spesso la condizione di un livello di ossigeno nel sangue continuamente basso, che non può completare la circolazione di cui sopra e stimolare il rene a secernere continuamente EPO, in modo che la concentrazione di EPO nel sangue sia superiore alla gente comune.
Ci sono voluti quasi 80 anni per scoprirlo
Come molte scoperte importanti, la comprensione dell'EPO da parte degli scienziati non è stata facile, con domande e sfide lungo il percorso. Ci sono voluti quasi 80 anni dal concetto di EPO alla determinazione finale della molecola specifica.
Nel 1906, gli scienziati francesi Carnot e Deflandre iniettarono a conigli normali il siero di conigli anemici e scoprirono che la conta dei globuli rossi nel plasma dei conigli normali aumentava. Credevano che alcuni fattori umorali nel plasma potessero stimolare e regolare la produzione di globuli rossi. Questo è stato il primo prototipo di concetto EPO. Sfortunatamente, i risultati non sono stati replicati nei decenni successivi, principalmente perché il conteggio dei nuovi globuli rossi non era accurato.
L'esperimento sulla parabiosi di Reissmann e Ruhenstroth-Bauer nel 1950 fornì una prova davvero forte. Hanno collegato chirurgicamente i sistemi circolatori di due topi viventi, ponendone uno in un ambiente ipossico e l'altro respirando aria normale. Di conseguenza, entrambi i topi hanno prodotto enormi quantità di globuli rossi. Non c'è dubbio che ci sia un ormone nel flusso sanguigno che stimola la produzione di globuli rossi, da cui l'EPO prende il nome. D'altra parte, l'EPO è molto sensibile all'ipossia.
Che molecola è l'EPO? Lo scienziato americano Goldwasser ha impiegato 30 anni per chiarire finalmente il problema a livello biochimico. Se un operaio vuole fare un buon lavoro, deve prima affilare i suoi attrezzi. La funzione dell'EPO è quella di stimolare nuovi globuli rossi, mail conteggio di quest'ultimo non è accurato. La molecola funzionale più importante nei globuli rossi è l'emoglobina contenente eme, che contiene uno ione ferroso al suo centro. Così il team di Goldwasser ha etichettato i globuli rossi neonati con isotopi di ferro radioattivi e ha sviluppato un metodo sensibile per rilevare l'attività dell'EPO. Ciò consente di isolare e purificare concentrazioni molto basse di EPO (nanogrammi per millilitro) da campioni di fluidi animali. Ma l'isolamento dell'EPO è stato estremamente difficile. Sono passati dal rene al plasma di pecora anemico, all'urina di pazienti con grave carenza di ferro dovuta a infezione da anchilostomi e infine, nel 1977, hanno purificato 8 milligrammi di proteina EPO umana da 2.550 litri di urina di pazienti giapponesi con anemia aplastica.
Nel 1985 furono completati il sequenziamento delle proteine e la clonazione genica dell'EPO umano. Il gene EPO codifica per un polipeptide con 193 residui amminici, che diventa una proteina matura composta da 166 residui amminici dopo che il peptide segnale è stato ritagliato durante la secrezione e contiene 4 siti per la modificazione della glicosilazione. Nel 1998 sono state analizzate la struttura della soluzione NMR dell'EPO e la struttura cristallina dell'EPO e del suo complesso recettoriale. A questo punto, le persone hanno la comprensione più intuitiva dell'EPO.
Fino ad ora, il trattamento per l'anemia di solito richiedeva trasfusioni di sangue per reintegrare la carenza di globuli rossi. Man mano che le persone imparano di più sull'EPO, l'iniezione per stimolare la produzione di globuli rossi nel proprio midollo osseo ha reso il problema più facile. Ma purificare l'EPO direttamente dai fluidi corporei, come ha fatto Goldwasser, è difficile e le rese sono basse. La determinazione della proteina EPO e della sequenza genica ha reso possibile la produzione di EPO umano ricombinante in grandi quantità.
È stato fatto da una società di biotecnologie chiamata Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen è stata fondata nel 1980 con solo sette membri, sperando di realizzare prodotti biofarmaceutici con le tecniche allora emergenti della biologia molecolare. L'interferone, il fattore di rilascio dell'ormone della crescita, il vaccino contro l'epatite B, il fattore di crescita epidermico erano tra i nomi caldi nella loro lista di bersagli, ma nessuno di questi tentativi ebbe successo. Fino al 1985, Lin Fukun, uno scienziato cinese di Taiwan, in Cina, ha clonato il gene dell'EPO umano e poi ha realizzato la produzione di EPO sintetico utilizzando la tecnologia di ricombinazione del DNA.
L'EPO umano ricombinante ha la stessa sequenza della proteina EPO endogena e ha anche una modifica della glicosilazione simile. Naturalmente, l'EPO umano ricombinante ha anche l'attività dell'EPO endogeno. Nel giugno 1989, il primo prodotto di Amgen, l'eritropoietina umana ricombinante Epogen, è stato approvato dalla FDA statunitense per il trattamento dell'anemia causata da insufficienza renale cronica e dell'anemia nel trattamento dell'infezione da HIV. Le vendite di Epogen hanno superato i 16 milioni di dollari in soli tre mesi. Nei due decenni successivi, Amgen ha dominato il mercato dell'EPO umano riassemblato. Epogen ha portato ad Amgen 2,5 miliardi di dollari di entrate solo nel 2010. Nel 2018, il valore del mercato azionario di Amgen era di $ 128,8 miliardi, rendendola l'ottava azienda farmaceutica più grande del mondo.
Vale la pena notare che Amgen inizialmente ha lavorato con Goldwasser per fornire proteine EPO umane purificate per il sequenziamento, ma Goldwasser e Amgen hanno presto litigato a causa di differenze ideologiche. Goldwasser e la sua Università di Chicago, che ha svolto ricerche di base, non hanno mai pensato di brevettare l'ormone da lui scoperto, e quindi non hanno ricevuto un centesimo per l'enorme successo commerciale dell'EPO.
È... com'è uno stimolante
Quando respiriamo, l'ossigeno entra nei mitocondri delle cellule per guidare la catena respiratoria e produrre enormi quantità di ATP, la principale fonte di energia nel nostro corpo. Le persone anemiche non hanno abbastanza globuli rossi sani e l'effetto più immediato è che non assorbono abbastanza ossigeno, il che li fa sentire stanchi, simili ai problemi respiratori durante una lunga corsa. Quando iniettato con EPO umano ricombinante, i corpi dei pazienti con anemia producono più globuli rossi,trasportare più ossigeno e produrre più della molecola energetica ATP, alleviando efficacemente i sintomi.
Tuttavia, anche alcuni operatori sportivi hanno iniziato a pensare all'EPO umano ricombinante. Se l'ormone ricombinante artificiale di tipo EPO viene utilizzato per stimolare il corpo degli atleti a produrre più globuli rossi, è possibile migliorare la capacità degli atleti di ottenere ossigeno e produrre molecole di energia, che possono anche migliorare le prestazioni degli atleti nella resistenza eventi come il ciclismo, la corsa a lunga distanza e lo sci di fondo. Un articolo del 1980 sul Journal of Applied Physiology ha mostrato che gli stimolanti del sangue (eritropoietina, trasportatori artificiali di ossigeno e trasfusioni di sangue) possono aumentare la resistenza del 34%. Se gli atleti usano l'EPO, possono correre 8 chilometri sul tapis roulant in 44 secondi in meno rispetto a prima. In effetti, il ciclismo e le maratone sono stati i peggiori trasgressori per gli stimolanti EPO. Durante il Tour de France del 1998, un medico della squadra spagnola del team Festina è stato arrestato al confine francese con 400 bottiglie di EPO ricombinante artificiale! Il risultato, ovviamente, è stato che l'intera squadra è stata espulsa dal Tour e bandita.
Il Comitato olimpico internazionale ha aggiunto l'EPO alla sua lista vietata ai Giochi di Barcellona del 1992, ma riorganizzare i test sull'EPO umano era così difficile che prima dei Giochi del 2000 non c'era modo di rilevare efficacemente se gli atleti lo stavano usando. Ci sono diversi motivi: 1) il contenuto di EPO nei fluidi corporei è molto basso e l'EPO per ml di sangue nelle persone normali è di circa 130-230 nanogrammi; 2) La composizione aminoacidica dell'EPO ricombinante artificiale è esattamente la stessa di quella della proteina EPO endogena umana, solo la forma della glicosilazione è leggermente diversa; 3) L'emivita dell'EPO nel sangue è di sole 5-6 ore ed è generalmente non rilevabile 4-7 giorni dopo l'ultima iniezione; 4) Il livello individuale di EPO è molto diverso, quindi è difficile stabilire uno standard quantitativo assoluto.
Dal 2000, WADA ha utilizzato il test delle urine come unico metodo di verifica scientifica per il rilevamento diretto dell'EPO ricombinante. A causa delle lievi differenze tra la forma glicoilata dell'EPO ricombinante artificiale e quella dell'EPO umano, le proprietà di carica delle due molecole sono molto piccole e possono essere distinte mediante un metodo di elettroforesi chiamato focalizzazione isoelettrica, che è la strategia principale per la rilevamento diretto dell'EPO ricombinante artificiale. Tuttavia, alcuni EPO ricombinanti espressi da cellule derivate dall'uomo non hanno mostrato differenze nella glicosilazione, quindi alcuni esperti hanno suggerito che l'EPO esogeno e l'EPO endogeno dovrebbero essere distinti dal diverso contenuto di isotopi di carbonio.
In effetti, ci sono ancora limitazioni nei diversi metodi di test per l'EPO. Ad esempio, Lance Armstrong, la leggenda del ciclismo americano, ha ammesso di aver assunto EPO e altri stimolanti durante le sue sette vittorie al Tour de France, ma in quel momento non è stato effettivamente confermato positivo all'EPO in nessun test antidoping. Dobbiamo ancora aspettare e vedere se è "un piede più alto" o "un piede più alto".
Come fa un premio Nobel
Un'ultima parola sulla connessione tra l'EPO e il Premio Nobel 2019 per la Fisiologia o la Medicina.
L'EPO è il caso più tipico di percezione e risposta del corpo umano all'ipossia. Pertanto, Semenza e Ratcliffe, due premi Nobel, hanno scelto l'EPO come punto di partenza per studiare il meccanismo di percezione cellulare e adattamento all'ipossia. Il primo passo è stato trovare gli elementi del gene EPO in grado di rispondere ai cambiamenti di ossigeno. Semenza ha identificato una sequenza chiave non codificante di 256 basi all'estremità 3' a valle del gene che codifica per l'EPO, chiamata elemento di risposta all'ipossia. Se questa sequenza di elementi viene mutata o eliminata, la capacità della proteina EPO di rispondere all'ipossia è notevolmente ridotta. Se questa sequenza di elementi è fusa all'estremità 3 'a valle di altri geni non associati all'ipossia, anche questi geni modificati mostrano un'attivazione simile all'EPOin condizioni di ipossia.
Ratcliffe e il suo team hanno poi scoperto che questo elemento di risposta ipossica non è presente solo nelle cellule renali o epatiche responsabili della produzione di EPO, ma anche in molti altri tipi di cellule che possono funzionare in condizioni ipossiche. In altre parole, questa risposta all'ipossia potrebbe non essere specifica dell'EPO, ma piuttosto un fenomeno più diffuso nelle cellule. Queste altre cellule, che non sono responsabili della produzione di EPO, devono contenere molecole (come i fattori di trascrizione responsabili dell'attivazione dell'espressione genica) che rilevano i cambiamenti nella concentrazione di ossigeno e si legano agli elementi di risposta ipossica per attivare geni come l'EPO.
