שלושת הזוכים בפרס נובל לפיזיולוגיה או רפואה לשנת 2019, וויליאם ג'י קיילין ג'וניור, גרג ל. סמנזה וסר פיטר ג'יי רטקליף כבר זכו בפרס לסקר לרפואה בסיסית לשנת 2016 על עבודתם על האופן שבו תאים חשים ומסתגלים. להיפוקסיה, אז זה לא היה מפתיע במיוחד. הם גילו וזיהו את מולקולת המפתח גורם 1 הניתן להיפוקסיה (HIF-1). היום אנחנו רוצים לחזור למקור המחקר, שהוא אריטרופואטין, או EPO, מולקולת פלא.

זה הגורם החשוב ביותר בייצור תאי דם אדומים

תאי דם אדומים הם הסוג הנפוץ ביותר של תאי דם בדם, והם המדיום העיקרי להובלת חמצן ופחמן דו חמצני בדם של בעלי חוליות. אריתרוציטים נוצרים במח העצם: תאי גזע המטופואטיים מתרבים לראשונה ומתמיינים לאבות של תאי דם שונים, ואבות אריתרואידים יכולים להתמיין ולהתבגר עוד יותר לאדומות. בתנאים רגילים, קצב ייצור אריתרוציטים בבני אדם נמוך מאוד, אך במצבי לחץ כמו דימום, המוליזה והיפוקסיה, ניתן להגביר את קצב ייצור האריתרוציטים עד פי שמונה. בתהליך זה, אריטרופואטין EPO הוא אחד הגורמים החשובים ביותר.

EPO הוא הורמון המסונתז בעיקר בכליה. הטבע הכימי שלו הוא חלבון בעל גליקוזילציה גבוהה. למה בכליות? בכל דקה זורם בערך ליטר דם דרך הכליות, כך שהן יכולות לזהות במהירות וביעילות שינויים ברמות החמצן בדם. כאשר רמות החמצן בדם נמוכות, הכליות מגיבות במהירות ומייצרות כמויות גדולות של EPO. האחרון מסתובב דרך זרם הדם אל מח העצם, שם הוא מקדם את ההמרה של תאי אבות אריתרואידים לתאי דם אדומים. תאי דם אדומים בוגרים משתחררים ממח העצם למערכת הדם כדי לשפר את יכולתו של הגוף להיקשר לחמצן. כאשר הכליות חשות עלייה בחמצן בדם, הן מפחיתות את ייצור ה-EPO, אשר בתורו מפחית את כמות תאי הדם האדומים במח העצם.

זה יוצר לולאת התאמה מושלמת. עם זאת, אנשים שחיים בגובה רב וחלק מחולי אנמיה נתקלים לעיתים קרובות במצב של רמת חמצן נמוכה מתמשכת בדם, שאינה יכולה להשלים את מחזור הדם לעיל ולעורר את הכליה להפריש ללא הרף EPO, כך שריכוז ה- EPO בדם גבוה יותר מאנשים רגילים.

לקח כמעט 80 שנה לחשוף אותו

כמו תגליות מרכזיות רבות, הבנתם של מדענים את EPO לא הייתה חלקה, עם שאלות ואתגרים לאורך הדרך. זה לקח כמעט 80 שנה מהרעיון של EPO ועד לקביעה הסופית של המולקולה הספציפית.

בשנת 1906, המדענים הצרפתים קרנו ודפלנדר הזריקו לארנבים נורמליים נסיוב של ארנבות אנמיות ומצאו שספירת תאי הדם האדומים בפלזמה של ארנבות רגילות גדלה. הם האמינו שכמה גורמים הומוראליים בפלזמה יכולים לעורר ולווסת את הייצור של תאי דם אדומים. זה היה אב הטיפוס הראשון לקונספט של EPO. למרבה הצער, התוצאות לא שוכפלו בעשורים הבאים, בעיקר בגלל שספירת תאי הדם האדומים החדשים לא הייתה מדויקת.

ניסוי הפרביוזה של רייסמן ורוהנסטרוט-באואר ב-1950 סיפק ראיות ממש חזקות. הם קישרו בניתוח את מערכות הדם של שתי חולדות חיות, והציבו אחת בסביבה היפוקסית והשנייה נושמת אוויר רגיל. כתוצאה מכך, שני העכברים ייצרו כמויות אדירות של כדוריות דם אדומות. אין ספק שיש הורמון בזרם הדם הממריץ את ייצור תאי הדם האדומים, שממנו קיבל EPO את שמו. מצד שני, EPO רגיש מאוד להיפוקסיה.

איזו מולקולה היא EPO? לקח למדען האמריקאי גולדווסר 30 שנה להבהיר סוף סוף את הבעיה ברמה הביוכימית. אם עובד רוצה לעשות עבודה טובה, עליו קודם כל לחדד את הכלים שלו. תפקידו של EPO הוא לעורר תאי דם אדומים חדשים, אבלהספירה של האחרונים אינה מדויקת. המולקולה התפקודית החשובה ביותר בתאי דם אדומים היא המוגלובין המכיל heme, המכיל יון ברזל במרכזו. אז הצוות של גולדווסר סימן תאי דם אדומים שזה עתה נולדו עם איזוטופי ברזל רדיואקטיביים ופיתח שיטה רגישה לזיהוי פעילות EPO. זה מאפשר לבודד ולטהר ריכוזים נמוכים מאוד של EPO (ננוגרם למיליליטר) מדגימות נוזלים של בעלי חיים. אבל הבידוד של EPO היה קשה ביותר. הם עברו מפלסמת כליות לפלסמת כבשים אנמית, לשתן של חולים עם מחסור חמור בברזל עקב זיהום בתולעי קרס, ולבסוף, ב-1977, טיהרו 8 מיליגרם של חלבון EPO אנושי מ-2,550 ליטר שתן מחולים יפנים עם אנמיה אפלסטית.

בשנת 1985 הושלמו רצף החלבון ושיבוט הגנים של EPO אנושי. הגן EPO מקודד לפוליפפטיד בעל 193 שאריות אמינו, שהופך לחלבון בוגר המורכב מ-166 שיירי חומצות אמינו לאחר שפפטיד האות נחתך במהלך ההפרשה, ומכיל 4 אתרים לשינוי גליקוזילציה. בשנת 1998 נותחו מבנה תמיסת ה-NMR של EPO ומבנה הגבישי של EPO וקומפלקס הקולטנים שלו. בשלב זה, לאנשים יש את ההבנה האינטואיטיבית ביותר של EPO.

עד כה, טיפול באנמיה הצריך בדרך כלל עירויי דם כדי לחדש את המחסור בכדוריות הדם האדומות. ככל שאנשים לומדים יותר על EPO, הזרקת אותו כדי לעורר ייצור תאי דם אדומים במח העצם שלהם הקלה על הבעיה. אבל טיהור EPO ישירות מנוזלי גוף, כפי שעשה גולדווסר, קשה והתפוקות נמוכות. קביעת חלבון EPO ורצף הגנים אפשרו לייצר EPO אנושי רקומביננטי בכמויות גדולות.

זה נעשה על ידי חברת ביוטכנולוגיה בשם Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen נוסדה בשנת 1980 עם שבעה חברים בלבד, בתקווה לייצר ביו-פרמצבטיקה עם הטכניקות שהתפתחו אז של ביולוגיה מולקולרית. אינטרפרון, גורם משחרר הורמון גדילה, חיסון נגד הפטיטיס B, גורם גדילה אפידרמיס היו בין השמות החמים ברשימת המטרות שלהם, אך אף אחד מהניסיונות הללו לא צלח. עד 1985, לין פוקון, מדען סיני מטייוואן, סין, שיבט את הגן של EPO אנושי, ולאחר מכן הבין ייצור של EPO סינתטי באמצעות טכנולוגיית ריקומבינציה של DNA.

ל-EPO אנושי רקומביננטי יש רצף זהה לחלבון EPO אנדוגני, ויש לו גם שינוי גליקוזילציה דומה. באופן טבעי, ל-EPO אנושי רקומביננטי יש גם פעילות של EPO אנדוגני. ביוני 1989, המוצר הראשון של אמג'ן, אריטרופואטין אנושי רקומביננטי אפוגן, אושר על ידי ה-FDA האמריקאי לטיפול באנמיה הנגרמת מאי ספיקת כליות כרונית ואנמיה בטיפול בזיהום HIV. מכירות אפוגן הגיעו ל-16 מיליון דולר תוך שלושה חודשים בלבד. במהלך שני העשורים הבאים, Amgen שלטה בשוק של EPO אנושי שהורכב מחדש. אפוגן הביאה לאמג'ן הכנסות של 2.5 מיליארד דולר ב-2010 לבדה. בשנת 2018, שווי שוק המניות של אמגן היה 128.8 מיליארד דולר, מה שהופך אותה לחברת התרופות השמינית בגודלה בעולם.

ראוי לציין כי Amgen עבדה בתחילה עם גולדווסר כדי לספק חלבוני EPO אנושיים מטוהרים לרצף, אך גולדווסר ואמגן התנתקו במהרה עקב הבדלים אידיאולוגיים. גולדווסר ואוניברסיטת שיקגו שלו, שעשו מחקר בסיסי, מעולם לא חשבו לרשום פטנט על ההורמון שגילה, ולכן לא קיבלו אגורה על ההצלחה המסחרית האדירה של EPO.

זה - איך זה ממריץ

כאשר אנו נושמים, חמצן חודר למיטוכונדריה של התאים כדי להניע את שרשרת הנשימה ולייצר כמויות אדירות של ATP, מקור האנרגיה העיקרי בגופנו. לאנשים אנמיים אין מספיק תאי דם אדומים בריאים, וההשפעה המיידית ביותר היא שהם לא קולטים מספיק חמצן, מה שגורם להם לתחושת עייפות, בדומה לבעיות נשימה במהלך ריצה ארוכה. כאשר הזרקת EPO אנושית רקומביננטית, גופם של חולי אנמיה מייצר יותר תאי דם אדומים,נושאים יותר חמצן, ומייצרים יותר ממולקולת האנרגיה ATP, ובכך מקל ביעילות על הסימפטומים.

עם זאת, חלק מעובדי הספורט החלו לחשוב גם על EPO אנושי רקומביננטי. אם משתמשים בהורמון הרקומביננטי המלאכותי מסוג EPO כדי לעורר את גוף הספורטאים לייצר יותר תאי דם אדומים, אפשר לשפר את יכולת הספורטאים להשיג חמצן ולייצר מולקולות אנרגיה, מה שיכול לשפר גם את ביצועי הספורטאים בסבולת אירועים כמו רכיבה על אופניים, ריצה למרחקים ארוכים וסקי קרוס קאנטרי. מאמר משנת 1980 ב-Journal of Applied Physiology הראה שממריצי דם (אריתרופואטין, נשאי חמצן מלאכותיים ועירוי דם) יכולים להגביר את הסיבולת ב-34 אחוזים. אם ספורטאים משתמשים ב-EPO, הם יכולים לרוץ 8 קילומטרים על ההליכון ב-44 שניות פחות זמן מבעבר. למעשה, רכיבה על אופניים ומרתונים היו העבריינים הגרועים ביותר עבור ממריצי EPO. במהלך הטור דה פראנס 1998, רופא נבחרת ספרדי של קבוצת פסטינה נעצר בגבול צרפת עם 400 בקבוקים של EPO רקומביננטי מלאכותי! התוצאה, כמובן, הייתה שכל הקבוצה הודחה מהטור והורחק.

הוועד האולימפי הבינלאומי הוסיף את EPO לרשימת האסורים שלו במשחקי ברצלונה 1992, אבל ארגון מחדש של בדיקות EPO אנושיות היה כל כך קשה שלפני משחקי 2000 לא הייתה דרך לזהות ביעילות אם ספורטאים משתמשים בו. ישנן מספר סיבות: 1) תכולת ה-EPO בנוזלי הגוף נמוכה מאוד, וה-EPO למ"ל דם באנשים רגילים הוא כ-130-230 ננוגרם; 2) הרכב חומצות האמינו של EPO רקומביננטי מלאכותי זהה לחלוטין לזה של חלבון EPO אנדוגני אנושי, רק צורת הגליקוזילציה שונה במקצת; 3) זמן מחצית החיים של EPO בדם הוא רק 5-6 ​​שעות, והוא בדרך כלל בלתי ניתן לזיהוי 4-7 ימים לאחר ההזרקה האחרונה; 4) רמת ה-EPO הפרט שונה מאוד, ולכן קשה לקבוע סטנדרט כמותי מוחלט.

מאז שנת 2000, WADA השתמשה בבדיקת שתן כשיטת האימות המדעית היחידה לזיהוי ישיר של EPO רקומביננטי. בשל ההבדלים הקלים בין הצורה הגלוקואילטית של ה-EPO הרקומביננטי המלאכותי לזו של ה-EPO האנושי, התכונות הטעונות של שתי המולקולות קטנות מאוד וניתן להבחין בהן באמצעות שיטת אלקטרופורזה הנקראת מיקוד איזואלקטרי, שהיא האסטרטגיה העיקרית עבור זיהוי ישיר של ה-EPO הרקומביננטי המלאכותי. עם זאת, חלק מה-EPO רקומביננטי המובע על ידי תאים שמקורם באדם לא הראה הבדל בגליקוזילציה, כך שכמה מומחים הציעו שיש להבחין בין EPO אקסוגני לבין EPO אנדוגני על ידי תכולת איזוטופי פחמן שונה.

למעשה, יש עדיין מגבלות בשיטות בדיקה שונות עבור EPO. לדוגמה, לאנס ארמסטרונג, אגדת האופניים האמריקאית, הודה שנטל EPO וחומרים ממריצים אחרים במהלך שבעת הניצחונות שלו בטור דה פראנס, אך למעשה לא אושר שהוא חיובי ל-EPO בשום בדיקת סימום באותו זמן. אנחנו עדיין צריכים לחכות ולראות אם זה "רגל אחת גבוה יותר" או "רגל אחת גבוה יותר".

איך זה מקבל פרס נובל

מילה אחרונה על הקשר בין EPO לפרס נובל בפיזיולוגיה או רפואה לשנת 2019.

EPO הוא המקרה האופייני ביותר של תפיסת הגוף האנושי ותגובתו להיפוקסיה. לכן, Semenza ו-Ratcliffe, שני חתני פרס נובל, בחרו ב-EPO כנקודת המוצא לחקר מנגנון תפיסת התא והסתגלות להיפוקסיה. הצעד הראשון היה למצוא את המרכיבים של הגן EPO שיכולים להגיב לשינויי חמצן. Semenza זיהה רצף מפתח של 256 בסיסים לא מקודד בקצה 3' במורד הזרם של הגן המקודד ל-EPO, בשם אלמנט התגובה להיפוקסיה. אם רצף האלמנטים הזה עובר מוטציה או מחיקה, יכולתו של חלבון ה-EPO להגיב להיפוקסיה מופחתת מאוד. אם רצף האלמנטים הזה מתמזג לקצה ה-3 במורד הזרם של גנים אחרים שאינם קשורים להיפוקסיה, הגנים המותאמים הללו מראים גם הפעלה דמוית EPOבתנאי היפוקסיה.

רטקליף וצוותו גילו אז שאלמנט התגובה ההיפוקסי הזה קיים לא רק בתאי הכליה או הכבד האחראים לייצור EPO, אלא גם בסוגי תאים רבים אחרים שיכולים לתפקד בתנאים היפוקסיים. במילים אחרות, ייתכן שתגובה זו להיפוקסיה אינה ספציפית ל-EPO, אלא תופעה נפוצה יותר בתאים. תאים אחרים אלה, שאינם אחראים לייצור EPO, חייבים להכיל מולקולות (כגון גורמי שעתוק האחראים להפעלת ביטוי גנים) שחשים שינויים בריכוז החמצן ונקשרים למרכיבי תגובה היפוקסית כדי להפעיל גנים כגון EPO.