2019 年のノーベル生理学・医学賞を受賞した 3 人のウィリアム G. ケーリン Jr.、グレッグ L. セメンザ、ピーター J. ラトクリフ卿は、細胞がどのように感知し、適応するかについての研究で、2016 年のラスカー基礎医学賞をすでに受賞していました。低酸素症になるので、特に驚くことではありませんでした。彼らは、重要な分子である低酸素誘導因子 1 (HIF-1) を発見し、同定しました。今日は、この研究の原点に戻りたいと思います。エリスロポエチン (EPO) は奇跡の分子です。

赤血球の生産において最も重要な要素です

赤血球は、血液中に最も豊富に存在するタイプの血球であり、脊椎動物の血液を通じて酸素と二酸化炭素を輸送するための主要な媒体です。赤血球は骨髄で生成されます。まず造血幹細胞が増殖してさまざまな血液細胞の前駆細胞に分化し、赤血球系前駆細胞がさらに分化して赤血球に成熟します。通常の状態では、人間の赤血球産生率は非常に低くなりますが、出血、溶血、低酸素症などのストレス下では、赤血球産生率が最大 8 倍に増加する可能性があります。この過程において、エリスロポエチン EPO は最も重要な因子の 1 つです。

EPOは主に腎臓で合成されるホルモンです。その化学的性質は、高度にグリコシル化されたタンパク質です。なぜ腎臓に？毎分約 1 リットルの血液が腎臓を通過するため、血液中の酸素レベルの変化を迅速かつ効率的に検出できます。血液中の酸素レベルが低い場合、腎臓は迅速に反応し、大量の EPO を生成します。後者は血流を通って骨髄に循環し、そこで赤血球前駆細胞の赤血球への変換を促進します。成熟した赤血球が骨髄から循環系に放出され、体の酸素結合能力が向上します。腎臓が血液中の酸素の増加を感知すると、EPO の産生が減少し、骨髄中の赤血球の量が減少します。

これにより、完全な調整ループが作成されます。しかし、高地に住んでいる人や一部の貧血患者は、血中酸素レベルが継続的に低い状態に遭遇することが多く、上記の循環を完了できず、腎臓を刺激して EPO を継続的に分泌させることができず、血中 EPO 濃度が一般の人よりも高くなります。

それを発見するのに80年近くかかった

多くの主要な発見と同様に、EPO に関する科学者の理解は順風満帆ではなく、その過程で疑問や課題が生じています。 EPO の概念から特定の分子の最終的な決定まで、80 年近くかかりました。

1906 年、フランスの科学者カルノーとデフランドルは、正常なウサギに貧血ウサギの血清を注射し、正常なウサギの血漿中の赤血球数が増加することを発見しました。彼らは、血漿中のいくつかの体液性因子が赤血球の産生を刺激および調節できると信じていました.これは、最初の EPO コンセプト プロトタイプでした。残念ながら、主に新しい赤血球の数が正確ではなかったため、結果はその後数十年間再現されていません.

1950 年の Reissmann と Ruhenstroth-Bauer のパラビオシス実験は、非常に強力な証拠を提供しました。彼らは、生きている 2 匹のラットの循環系を外科的に接続し、1 匹を低酸素環境に置き、もう 1 匹を通常の空気で呼吸させました。その結果、両方のマウスが大量の赤血球を産生しました。血流中に赤血球の産生を刺激するホルモンが存在することは疑いの余地がなく、EPO の名前の由来となっています。一方、EPO は低酸素に非常に敏感です。

EPOとはどのような分子ですか?アメリカの科学者ゴールドワッサーは、生化学レベルで問題を最終的に解明するのに30年かかりました.労働者が良い仕事をしたいのなら、まず道具を研がなければなりません。 EPO の機能は、新しい赤血球を刺激することですが、後者のカウントは正確ではありません。赤血球の最も重要な機能分子は、ヘムを含むヘモグロビンであり、その中心に鉄イオンが含まれています。そこで、Goldwasser のチームは、新生児の赤血球を放射性鉄同位体で標識し、EPO 活性を検出する感度の高い方法を開発しました。これにより、動物の体液サンプルから非常に低濃度の EPO (1 ミリリットルあたりのナノグラム) を分離および精製することが可能になります。しかし、EPO の分離は非常に困難でした。彼らは、腎臓から貧血ヒツジ血漿、鉤虫感染による重度の鉄欠乏症患者の尿に切り替え、最終的に 1977 年に再生不良性貧血の日本人患者の 2,550 リットルの尿から 8 ミリグラムのヒト EPO タンパク質を精製しました.

1985 年に、ヒト EPO のタンパク質配列決定と遺伝子クローニングが完了しました。 EPO 遺伝子は、分泌時にシグナルペプチドが切り取られた後、166 アミノ酸残基からなる成熟タンパク質となる 193 アミノ残基のポリペプチドをコードし、4 つの糖鎖修飾部位を含みます。 1998年には、EPOのNMR溶液構造とEPOとその受容体複合体の結晶構造が解析されました。この時点で、人々は EPO を最も直感的に理解しています。

これまで、貧血の治療には通常、不足している赤血球を補充するために輸血が必要でした。人々が EPO についてさらに学ぶにつれて、自分の骨髄での赤血球産生を刺激するために EPO を注射することで、問題が解決しやすくなりました。しかし、Goldwasser が行ったように、体液から EPO を直接精製することは困難であり、収率は低い. EPO タンパク質と遺伝子配列の決定により、組換えヒト EPO を大量に生産することが可能になりました。

これは、Applied Molecular Genetics (Amgen) というバイオテクノロジー企業によって行われました。 Amgen は 1980 年にわずか 7 人のメンバーで設立され、当時出現していた分子生物学の技術を利用してバイオ医薬品を製造することを目指していました。インターフェロン、成長ホルモン放出因子、B 型肝炎ワクチン、表皮成長因子は、彼らの標的リストのホットな名前の 1 つでしたが、これらの試みはいずれも成功しませんでした。 1985 年まで、中国の台湾出身の中国人科学者であるリン・フクンは、ヒト EPO の遺伝子をクローニングし、DNA 組換え技術を使用して合成 EPO の生産を実現しました。

組換えヒト EPO は、内因性 EPO タンパク質と同じ配列を持ち、同様のグリコシル化修飾も持っています。当然のことながら、組み換えヒト EPO は内因性 EPO の活性も持っています。 1989 年 6 月、Amgen の最初の製品である組換え型ヒトエリスロポエチン Epogen が、慢性腎不全に起因する貧血および HIV 感染症の治療における貧血の治療薬として、米国 FDA によって承認されました。 Epogen の売り上げは、わずか 3 か月で 1,600 万ドルを突破しました。次の 20 年間、アムジェン社は再構築されたヒト EPO の市場を独占しました。 Epogen は、2010 年だけで Amgen に 25 億ドルの収益をもたらしました。 2018 年のアムジェンの株式市場価値は 1,288 億ドルで、世界で 8 番目に大きい製薬会社になりました。

Amgen が最初に Goldwasser と協力して配列決定用の精製ヒト EPO タンパク質を提供したことは注目に値しますが、Goldwasser と Amgen はイデオロギーの違いによりすぐに仲直りしました。ゴールドワッサーと基礎研究を行った彼のシカゴ大学は、彼が発見したホルモンの特許を取得しようとは考えていなかったので、EPO の巨大な商業的成功に対して一銭も受け取っていません。

それは - どのように覚せい剤です

呼吸すると、酸素が細胞のミトコンドリアに入り、呼吸鎖を駆動し、体内の主なエネルギー源である ATP を大量に生成します。貧血の人は十分な健康な赤血球を持っていません。最も直接的な影響は、十分な酸素を取り込めないことです。これにより、長時間の呼吸の問題と同様に、疲れを感じます.組み換えヒト EPO を注射すると、貧血患者の体内でより多くの赤血球が生成され、より多くの酸素を運び、より多くのエネルギー分子 ATP を生成し、症状を効果的に緩和します。

しかし、一部のスポーツ関係者は組換えヒト EPO について考え始めています。 EPO 型の人工組換えホルモンを使用してアスリートの体を刺激し、より多くの赤血球を生成させると、アスリートの酸素取得能力とエネルギー分子を生成する能力が向上し、アスリートの持久力のパフォーマンスも向上する可能性があります。サイクリング、長距離走、クロスカントリースキーなどのイベント。 Journal of Applied Physiology に掲載された 1980 年の論文では、血液刺激剤 (エリスロポエチン、人工酸素運搬体、輸血) が持久力を 34% 増加させることが示されました。アスリートが EPO を使用すると、トレッドミルで 8 km を以前よりも 44 秒短い時間で走ることができます。実際、サイクリングとマラソンは EPO 覚醒剤の最悪の犯罪者です。 1998年のツール・ド・フランスでは、フェスティナチームのスペイン人チームドクターが、400本の人工組換えEPOを持ってフランス国境で逮捕されました!もちろん、その結果、チーム全体がツアーから追い出され、禁止されました。

国際オリンピック委員会は、1992 年のバルセロナ大会で EPO を禁止リストに追加しましたが、人間の EPO テストを再編成することは非常に困難であったため、2000 年の大会までは、アスリートが EPO を使用しているかどうかを効果的に検出する方法がありませんでした.いくつか理由があります。 2) 人工組換え EPO のアミノ酸組成は、ヒト内因性 EPO タンパク質のアミノ酸組成とまったく同じですが、グリコシル化の形態がわずかに異なるだけです。 3) EPO の血中半減期はわずか 5 ～ 6 時間で、通常、最後の注射から 4 ～ 7 日後には検出されません。 4) 個々の EPO レベルは非常に異なるため、絶対的な定量基準を確立することは困難です。

2000 年以来、WADA は組換え EPO を直接検出するための唯一の科学的検証方法として尿検査を使用してきました。人工組換え EPO のグリコシル化形態とヒト EPO のグリコシル化形態とのわずかな違いにより、2 つの分子の荷電特性は非常に小さく、等電点電気泳動と呼ばれる電気泳動法によって区別できます。人工組換え EPO の直接検出。しかし、ヒト由来細胞によって発現された一部の組換え EPO はグリコシル化に違いを示さなかったため、一部の専門家は、外因性 EPO と内因性 EPO は異なる炭素同位体含有量によって区別されるべきであると示唆しました。

実際、EPO のさまざまなテスト方法にはまだ制限があります。たとえば、アメリカのサイクリング界のレジェンドであるランス アームストロングは、ツール ド フランスで 7 勝を挙げている間に EPO やその他の覚せい剤を服用していたことを認めましたが、当時のドーピング検査で EPO 陽性とは確認されませんでした。それが「1フィート高い」か「1フィート高い」かは、まだ様子見です。

ノーベル賞をどうするか

EPO と 2019 年のノーベル生理学・医学賞との関係について、最後に一言。

EPO は、低酸素に対する人体の知覚と反応の最も典型的なケースです。したがって、2 人のノーベル賞受賞者である Semenza と Ratcliffe は、細胞の知覚と低酸素への適応のメカニズムを研究するための出発点として EPO を選びました。最初のステップは、酸素の変化に応答できる EPO 遺伝子の要素を見つけることでした。 Semenza は、低酸素応答要素と名付けられた、EPO をコードする遺伝子の 3' 下流端にある重要な 256 塩基の非コード配列を特定しました。この要素配列が変異または欠失すると、低酸素に応答する EPO タンパク質の能力が大幅に低下します。この要素配列が低酸素症に関連しない他の遺伝子の下流の 3' 末端に融合されている場合、これらの改変された遺伝子も EPO 様の活性化を示します。低酸素条件下で。

Ratcliffe と彼のチームは、この低酸素応答要素が、EPO の産生に関与する腎臓または肝細胞だけでなく、低酸素条件下で機能できる他の多くの細胞タイプにも存在することを発見しました。言い換えれば、この低酸素に対する反応は EPO に固有のものではなく、細胞内のより広範な現象である可能性があります。これらの他の細胞は、EPO の生成に関与していませんが、酸素濃度の変化を感知し、低酸素応答要素に結合して EPO などの遺伝子をオンにする分子 (遺伝子発現のオンに関与する転写因子など) を含んでいる必要があります。