Физиология немесе медицина бойынша 2019 жылғы Нобель сыйлығының үш иегері кіші Уильям Г.Кэлин, Грегг Л.Семенза және сэр Питер Дж.Рэтклифф жасушалардың қалай сезетіні және бейімделетіні туралы жұмысы үшін негізгі медицина бойынша 2016 жылғы Ласкер сыйлығын жеңіп алған болатын. гипоксияға дейін, сондықтан бұл таңқаларлық емес. Олар негізгі молекула гипоксия-индукциялық фактор 1 (HIF-1) ашты және анықтады. Бүгін біз зерттеудің пайда болуына қайта оралғымыз келеді, ол эритропоэтин немесе EPO, ғажайып молекула.
Бұл қызыл қан жасушаларын өндірудегі ең маңызды фактор
Қызыл қан жасушалары қандағы қан жасушаларының ең көп таралған түрі болып табылады және омыртқалы жануарлардың қаны арқылы оттегі мен көмірқышқыл газын тасымалдаудың негізгі ортасы болып табылады. Эритроциттер сүйек кемігінде түзіледі: гемопоэтикалық дің жасушалары алдымен көбейіп, әртүрлі қан жасушаларының ізашарларына дифференцияланады, ал эритроидты ізашарлар эритроциттерге әрі қарай дифференцияланып, жетіледі. Қалыпты жағдайда адам эритроциттерін өндіру жылдамдығы өте төмен, бірақ қан кету, гемолиз және гипоксия сияқты стресс жағдайында эритроциттерді өндіру жылдамдығы сегіз есеге дейін артуы мүмкін. Бұл процесте эритропоэтин ЭПО маңызды факторлардың бірі болып табылады.
ЭПО – негізінен бүйректе синтезделетін гормон. Оның химиялық табиғаты жоғары гликозилденген ақуыз болып табылады. Неліктен бүйректе? Бүйрек арқылы минут сайын шамамен бір литр қан өтеді, сондықтан олар қандағы оттегі деңгейінің өзгеруін тез және тиімді анықтай алады. Қандағы оттегі деңгейі төмен болғанда, бүйрек тез жауап береді және көп мөлшерде ЭПО шығарады. Соңғысы қан ағымы арқылы сүйек кемігіне айналады, онда эритроидты прогениторлық жасушалардың эритроциттерге айналуына ықпал етеді. Ағзаның оттегімен байланысу қабілетін жақсарту үшін сүйек кемігінен қан айналым жүйесіне жетілген эритроциттер шығарылады. Бүйректер қандағы оттегінің көбеюін сезгенде, олар EPO өндірісін азайтады, бұл өз кезегінде сүйек кемігіндегі эритроциттердің мөлшерін азайтады.
Бұл тамаша реттеу циклін жасайды. Алайда, жоғары биіктікте тұратын адамдар және анемиямен ауыратын кейбір науқастар қандағы оттегі деңгейінің үздіксіз төмендігі жағдайына жиі кездеседі, бұл жоғарыда аталған айналымды аяқтай алмайды және бүйректі үздіксіз ЭПО шығаруға ынталандырады, осылайша қандағы EPO концентрациясы қарапайым адамдарға қарағанда жоғары болады.
Оны ашу үшін шамамен 80 жыл қажет болды
Көптеген ірі жаңалықтар сияқты, ғалымдардың ЕПО туралы түсінігі де сұрақтар мен қиындықтарға тап болған жоқ. EPO тұжырымдамасынан нақты молекуланы түпкілікті анықтауға дейін шамамен 80 жыл өтті.
1906 жылы француз ғалымдары Карно мен Дефландр қалыпты қояндарға қаны аз қояндардың сарысуын енгізіп, қалыпты қояндардың плазмасындағы эритроциттер саны көбейетінін анықтады. Олар плазмадағы кейбір гуморальды факторлар қызыл қан жасушаларының өндірісін ынталандырып, реттей алады деп сенді. Бұл EPO концепциясының алғашқы прототипі болды. Өкінішке орай, нәтижелер кейінгі онжылдықтарда қайталанбады, негізінен жаңа қызыл қан жасушаларының саны дәл болмағандықтан.
1950 жылы Рейсман мен Рухенстрот-Бауэрдің парабиоз тәжірибесі шынымен күшті дәлелдер берді. Олар екі тірі егеуқұйрықтың қан айналымы жүйесін хирургиялық жолмен байланыстырып, біреуін гипоксиялық ортаға орналастырды, ал екіншісін қалыпты ауамен тыныс алды. Нәтижесінде екі тышқан да қызыл қан жасушаларының көп мөлшерін шығарды. Қан ағымында эритроциттердің өндірісін ынталандыратын гормон бар екеніне күмән жоқ, ол ЭПО өз атауын алады. Екінші жағынан, EPO гипоксияға өте сезімтал.
ЭПО дегеніміз қандай молекула? Мәселені биохимиялық деңгейде түпкілікті анықтау үшін американдық ғалым Голдвассерге 30 жыл қажет болды. Жұмысшы жақсы жұмыс істегісі келсе, ең алдымен құрал-сайманын қайрау керек. EPO функциясы жаңа қызыл қан жасушаларын ынталандыру болып табылады, бірақсоңғысының саны дәл емес. Эритроциттердің ең маңызды функционалдық молекуласы - гемоглобин, оның ортасында темір ионы бар гемоглобин. Осылайша, Голдвассер тобы жаңа туылған қызыл қан жасушаларын радиоактивті темір изотоптарымен белгіледі және EPO белсенділігін анықтаудың сезімтал әдісін жасады. Бұл жануарлар сұйықтығы үлгілерінен EPO өте төмен концентрацияларын (миллилитрдегі нанограммалар) бөліп алуға және тазартуға мүмкіндік береді. Бірақ EPO оқшаулау өте қиын болды. Олар бүйректен анемияға ұшыраған қой плазмасына, анкилостом инфекциясынан ауыр темір тапшылығы бар науқастардың зәріне көшті және ақырында, 1977 жылы апластикалық анемиямен ауыратын жапондық науқастардың 2550 литр зәрінен 8 миллиграмм адамның EPO протеинін тазартты.
1985 жылы адам ЭПО-ның ақуызды секвенирлеу және гендік клондау аяқталды. EPO гені 193 амин қалдығы бар полипептидті кодтайды, ол секреция кезінде сигналдық пептид кесілгеннен кейін 166 амин қышқылы қалдықтарынан тұратын жетілген ақуызға айналады және гликозилдену модификациясы үшін 4 учаскеден тұрады. 1998 жылы ЭПО-ның ЯМР ерітіндісінің құрылымы және ЭПО-ның кристалдық құрылымы және оның рецепторлық кешені талданды. Осы кезде адамдарда EPO туралы ең интуитивті түсінік бар.
Осы уақытқа дейін анемияны емдеу үшін әдетте қызыл қан жасушаларының тапшылығын толтыру үшін қан құю қажет болды. Адамдар EPO туралы көбірек білген сайын, оны өздерінің сүйек кемігінде қызыл қан жасушаларының өндірісін ынталандыру үшін инъекциялау мәселені жеңілдетеді. Бірақ Голдвассер сияқты EPO-ны дене сұйықтықтарынан тікелей тазарту қиын және өнімділігі төмен. EPO протеинін және ген тізбегін анықтау адам рекомбинантты ЭПО-ны көп мөлшерде шығаруға мүмкіндік берді.
Мұны Applied Molecular Genetics (Amgen) деп аталатын биотехнологиялық компания жасады. Amgen 1980 жылы небәрі жеті мүшеден тұратын, сол кезде пайда болған молекулалық биология әдістерімен биофармацевтикалық препараттар жасауға үміттенген. Интерферон, өсу гормонын шығаратын фактор, В гепатитіне қарсы вакцина, эпидермиялық өсу факторы олардың мақсаттар тізімінде қызық атаулар болды, бірақ бұл әрекеттердің ешқайсысы сәтті болмады. 1985 жылға дейін Тайваньдағы (Қытай) қытайлық ғалым Лин Фукун адамның ЭПО генін клондады, содан кейін ДНҚ рекомбинация технологиясын қолдана отырып, синтетикалық ЭПО өндіруді жүзеге асырды.
Рекомбинантты адам ЭПО эндогендік EPO протеинімен бірдей реттілікке ие, сонымен қатар ұқсас гликозилдену модификациясына ие. Әрине, адамның рекомбинантты ЭПО-да эндогендік ЭПО белсенділігі де бар. 1989 жылдың маусым айында Амгеннің бірінші өнімі, рекомбинантты адам эритропоэтині Эпоген, АҚТҚ-инфекциясын емдеуде созылмалы бүйрек жеткіліксіздігінен туындаған анемия мен анемияны емдеу үшін АҚШ FDA-мен мақұлданды. Эпогеннің сатылымы үш айда 16 миллион доллардан асты. Келесі екі онжылдықта Амген қайта жиналған адам EPO нарығында үстемдік етті. Epogen тек 2010 жылы Амгенге 2,5 миллиард доллар табыс әкелді. 2018 жылы Амгеннің қор нарығының құны $128,8 млрд құрады, бұл оны әлемдегі сегізінші ірі фармацевтикалық компанияға айналдырды.
Айта кету керек, Amgen бастапқыда Голдвассермен бірге адам EPO тазартылған протеиндерін секвенирлеу үшін қамтамасыз ету үшін жұмыс істеді, бірақ Голдвассер мен Амген көп ұзамай идеологиялық келіспеушіліктерге байланысты істен шықты. Голдвассер және оның Чикаго университеті іргелі зерттеулер жүргізген, ол ашқан гормонды патенттеуді ешқашан ойлаған жоқ, сондықтан EPO-ның үлкен коммерциялық табысы үшін бір тиын да алған жоқ.
Бұл -- бұл қалай стимулятор
Біз тыныс алғанда оттегі жасушалардың митохондрияларына еніп, тыныс алу тізбегін қозғалысқа келтіреді және денеміздегі энергияның негізгі көзі болып табылатын АТФ көп мөлшерін шығарады. Анемиясы бар адамдарда сау қызыл қан жасушалары жеткіліксіз және ең бірден әсер ететін нәрсе - олар жеткілікті мөлшерде оттегін қабылдамайды, бұл ұзақ уақыт бойы тыныс алу проблемаларына ұқсас, оларды шаршатады. Рекомбинантты адам ЭПО инъекциясы кезінде анемиямен ауыратын науқастардың денесі қызыл қан жасушаларын көбірек шығарады,көбірек оттегін тасымалдайды және АТФ энергия молекуласын көбірек өндіреді, симптомдарды тиімді жеңілдетеді.
Дегенмен, кейбір спорт қызметкерлері адам рекомбинантты EPO туралы ойлана бастады. Егер EPO типті жасанды рекомбинантты гормон спортшылардың денесін көбірек қызыл қан жасушаларын өндіруге ынталандыру үшін пайдаланылса, спортшылардың оттегін алу және энергия молекулаларын өндіру қабілетін жақсартуға болады, бұл спортшылардың төзімділік көрсеткіштерін де жақсарта алады. велосипед тебу, ұзақ қашықтыққа жүгіру және шаңғы жарысы сияқты іс-шаралар. 1980 жылы Journal of Applied Physiology журналындағы мақала қан стимуляторлары (эритропоэтин, жасанды оттегі тасымалдаушылары және қан құю) төзімділікті 34 пайызға арттыратынын көрсетті. Егер спортшылар EPO пайдаланатын болса, олар жүгіру жолында бұрынғыға қарағанда 44 секундта 8 шақырымға жүгіре алады. Шын мәнінде, велоспорт пен марафондар EPO стимуляторлары үшін ең нашар құқық бұзушылар болды. 1998 жылғы Тур де Франс кезінде Фестина командасының испан командасының дәрігері Франция шекарасында 400 бөтелке жасанды рекомбинантты ЭПО-мен ұсталды! Нәтиже, әрине, бүкіл команда Турдан шығарылып, тыйым салынды.
Халықаралық Олимпиада комитеті 1992 жылғы Барселона ойындарында тыйым салынған тізімге EPO қосты, бірақ адамның EPO тестін қайта ұйымдастыру қиын болғаны сонша, 2000 жылғы Ойындарға дейін спортшылардың оны пайдаланып жатқанын тиімді анықтаудың ешқандай жолы болмады. Оның бірнеше себептері бар: 1) дене сұйықтықтарындағы ЭПО мөлшері өте төмен, ал қалыпты адамдарда қанның мл-іне ЭПО шамамен 130-230 нанограммды құрайды; 2) Жасанды рекомбинантты ЭПО-ның аминқышқылдық құрамы адамның эндогендік ЭПО протеинімен бірдей, тек гликозилдену формасы өте аз ғана ерекшеленеді; 3) қандағы ЕПО-ның жартылай шығарылу кезеңі небәрі 5-6 сағатты құрайды және ол соңғы инъекциядан кейін 4-7 күннен кейін әдетте анықталмайды; 4) Жеке ЭПО деңгейі өте әртүрлі, сондықтан абсолютті сандық стандартты орнату қиын.
2000 жылдан бастап WADA рекомбинантты ЭПО-ны тікелей анықтаудың жалғыз ғылыми тексеру әдісі ретінде зәр анализін қолданды. Жасанды рекомбинантты ЭПО-ның гликолилденген түрі мен адам ЭПО-ның арасындағы шамалы айырмашылықтарға байланысты екі молекуланың зарядталған қасиеттері өте аз және оларды изоэлектрлік фокустау деп аталатын электрофорез әдісімен ажыратуға болады, бұл негізгі стратегия болып табылады. жасанды рекомбинантты ЭПО-ны тікелей анықтау. Дегенмен, адам туынды жасушаларымен экспрессияланған кейбір рекомбинантты ЭПО гликозилденуде ешқандай айырмашылықты көрсетпеді, сондықтан кейбір сарапшылар экзогендік ЭПО және эндогендік ЭПО әртүрлі көміртегі изотоптарының мазмұнымен ерекшеленуі керек деп ұсынды.
Шын мәнінде, EPO үшін әртүрлі сынақ әдістерінде әлі де шектеулер бар. Мысалы, американдық велошабандоз Лэнс Армстронг Тур де Франстағы жеті жеңісі кезінде EPO және басқа да стимуляторларды қабылдағанын мойындады, бірақ ол кезде ешқандай допинг сынамасынан EPO оң нәтиже бермеді. Әлі «бір фут биіктікте» ме, әлде «бір фут биіктікте» ме, күтуіміз керек.
Бұл Нобель сыйлығын қалай береді
EPO мен физиология немесе медицина саласындағы 2019 жылғы Нобель сыйлығы арасындағы байланыс туралы соңғы сөз.
ЭПО – адам ағзасының гипоксияға реакциясы мен қабылдауының ең типтік жағдайы. Сондықтан Нобель сыйлығының екі лауреаты Семенца мен Рэтклифф жасушаларды қабылдау және гипоксияға бейімделу механизмін зерттеудің бастапқы нүктесі ретінде EPO таңдады. Бірінші қадам оттегі өзгерістеріне жауап бере алатын EPO генінің элементтерін табу болды. Семенза гипоксияға жауап беретін элемент деп аталатын EPO кодтайтын геннің 3 'төменгі ағынында негізгі 256-базалық кодталмаған тізбекті анықтады. Егер бұл элементтер тізбегі мутацияланса немесе жойылса, EPO ақуызының гипоксияға жауап беру қабілеті айтарлықтай төмендейді. Егер бұл элементтер тізбегі гипоксиямен байланысты емес басқа гендердің төменгі 3 'соңына біріктірілсе, бұл модификацияланған гендер де EPO тәрізді активтенуді көрсетеді.гипоксия жағдайында.
Содан кейін Рэтклифф пен оның командасы бұл гипоксиялық реакция элементі EPO өндіруге жауапты бүйрек немесе бауыр жасушаларында ғана емес, сонымен қатар гипоксиялық жағдайда жұмыс істей алатын көптеген басқа жасуша түрлерінде де бар екенін анықтады. Басқаша айтқанда, гипоксияға бұл жауап EPO-ға тән емес, жасушаларда кең таралған құбылыс болуы мүмкін. EPO өндірісіне жауап бермейтін бұл басқа жасушаларда оттегі концентрациясындағы өзгерістерді сезетін және EPO сияқты гендерді қосу үшін гипоксиялық реакция элементтерімен байланысатын молекулалар (гендердің экспрессиясын қосуға жауапты транскрипция факторлары сияқты) болуы керек.
