2019년 노벨 생리의학상 수상자 세 명인 William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza 및 Sir Peter J. Ratcliffe는 세포가 감지하고 적응하는 방법에 대한 연구로 2016년 기본 의학에서 Lasker Prize를 이미 수상했습니다. 저산소증에, 그래서 그것은 특별히 놀라운 일이 아니었습니다. 그들은 핵심 분자 저산소증 유도 인자 1(HIF-1)을 발견하고 확인했습니다. 오늘 우리는 기적의 분자인 에리스로포이에틴(EPO)이라는 연구의 기원으로 돌아가고자 합니다.

적혈구 생산에 가장 중요한 요소입니다.

적혈구는 혈액에서 가장 풍부한 유형의 혈액 세포이며 척추 동물의 혈액을 통해 산소와 이산화탄소를 운반하는 주요 매개체입니다. 적혈구는 골수에서 생성된다: 조혈모세포가 먼저 증식하여 다양한 혈액세포의 전구체로 분화되고, 적혈구 전구세포는 더 나아가 적혈구로 분화 및 성숙될 수 있다. 정상적인 조건에서 인간의 적혈구 생산 속도는 매우 낮지만 출혈, 용혈, 저산소증과 같은 스트레스 상태에서는 적혈구 생산 속도가 최대 8배까지 증가할 수 있습니다. 이 과정에서 erythropoietin EPO는 가장 중요한 요소 중 하나입니다.

EPO는 주로 신장에서 합성되는 호르몬입니다. 그 화학적 성질은 고도로 글리코실화된 단백질입니다. 왜 신장에? 매분 약 1리터의 혈액이 신장을 통해 흐르므로 신장은 혈액 내 산소 수치의 변화를 빠르고 효율적으로 감지할 수 있습니다. 혈중 산소 수치가 낮으면 신장이 빠르게 반응하여 다량의 EPO를 생성합니다. 후자는 혈류를 통해 골수로 순환하여 적혈구 전구 세포의 적혈구로의 전환을 촉진합니다. 성숙한 적혈구는 골수에서 순환계로 방출되어 신체의 산소 결합 능력을 향상시킵니다. 신장이 혈액 내 산소 증가를 감지하면 EPO 생산을 감소시켜 골수 내 적혈구의 양을 줄입니다.

이것은 완벽한 조정 루프를 만듭니다. 그러나 높은 고도에 사는 사람들과 일부 빈혈 환자는 종종 혈중 산소 수치가 지속적으로 낮은 상태에 직면하여 위의 순환을 완료할 수 없고 신장을 자극하여 지속적으로 EPO를 분비하므로 혈중 EPO 농도가 일반인보다 높습니다.

그것을 밝히는데 거의 80년이 걸렸다.

많은 주요 발견과 마찬가지로 EPO에 대한 과학자들의 이해는 그 과정에서 질문과 도전이 있는 순조로운 항해가 아니었습니다. EPO의 개념에서 특정 분자의 최종 결정까지 거의 80년이 걸렸습니다.

1906년 프랑스 과학자 Carnot와 Deflandre는 정상 토끼에게 빈혈 토끼의 혈청을 주사한 결과 정상 토끼의 혈장에서 적혈구 수가 증가하는 것을 발견했습니다. 그들은 혈장의 일부 체액성 요인이 적혈구 생성을 자극하고 조절할 수 있다고 믿었습니다. 이것은 최초의 EPO 개념 프로토타입이었습니다. 불행하게도 그 결과는 새로운 적혈구 수가 정확하지 않았기 때문에 이후 수십 년 동안 재현되지 않았습니다.

1950년 Reissmann과 Ruhenstroth-Bauer의 병체결합 실험은 정말 강력한 증거를 제공했습니다. 그들은 두 마리의 살아있는 쥐의 순환계를 외과적으로 연결하여 한 마리는 저산소 환경에, 다른 한 마리는 정상적인 공기를 호흡하도록 했습니다. 그 결과 두 쥐 모두 엄청난 양의 적혈구를 생산했습니다. EPO가 그 이름을 얻은 적혈구 생산을 자극하는 호르몬이 혈류에 있다는 것은 의심의 여지가 없습니다. 반면에 EPO는 저산소증에 매우 민감합니다.

EPO는 어떤 분자입니까? 마침내 생화학적 수준에서 문제를 명확히 하는 데 미국 과학자 Goldwasser가 30년이 걸렸습니다. 일꾼이 일을 잘하고 싶다면 먼저 도구를 갈고 닦아야 합니다. EPO의 기능은 새로운 적혈구를 자극하는 것이지만,후자의 계산은 정확하지 않습니다. 적혈구에서 가장 중요한 기능 분자는 헤모글로빈 함유 헴(heme)으로, 중심에 철 이온을 함유하고 있습니다. 그래서 Goldwasser의 팀은 방사성 철 동위원소로 신생아 적혈구에 표지를 지정하고 EPO 활동을 감지하는 민감한 방법을 개발했습니다. 이를 통해 동물 체액 샘플에서 매우 낮은 농도의 EPO(밀리리터당 나노그램)를 분리하고 정제할 수 있습니다. 그러나 EPO의 분리는 극히 어려웠다. 그들은 신장에서 빈혈 양 혈장으로, 십이지장충 감염으로 인한 심각한 철분 결핍 환자의 소변으로 전환했으며, 마침내 1977년 일본 재생불량성 빈혈 환자의 소변 2,550리터에서 인간 EPO 단백질 8mg을 정제했습니다.

1985년에 인간 EPO의 단백질 시퀀싱과 유전자 클로닝이 완료되었습니다. EPO 유전자는 193개의 아미노 잔기를 가진 폴리펩티드를 암호화하는데, 이는 신호 펩티드가 분비 중에 잘린 후 166개의 아미노산 잔기로 구성된 성숙한 단백질이 되고 글리코실화 변형을 위한 4개의 부위를 포함합니다. 1998년에는 EPO의 NMR 용액 구조와 EPO의 결정 구조 및 그 수용체 복합체가 분석되었다. 이 시점에서 사람들은 EPO를 가장 직관적으로 이해합니다.

지금까지 빈혈 치료는 일반적으로 적혈구 결핍을 보충하기 위해 수혈이 필요했습니다. 사람들이 EPO에 대해 더 많이 알게 됨에 따라 자신의 골수에서 적혈구 생산을 자극하기 위해 EPO를 주사하면 문제가 더 쉬워졌습니다. 그러나 Goldwasser처럼 체액에서 직접 EPO를 정제하는 것은 어렵고 수율도 낮습니다. EPO 단백질 및 유전자 서열의 결정은 재조합 인간 EPO를 대량으로 생산하는 것을 가능하게 했다.

그것은 Applied Molecular Genetics(Amgen)라는 생명 공학 회사에서 수행했습니다. Amgen은 1980년에 단 7명의 회원으로 설립되었으며 당시 부상했던 분자 생물학 기술로 바이오 의약품을 만들기를 희망했습니다. 인터페론, 성장 호르몬 방출 인자, B형 간염 백신, 표피 성장 인자가 표적 목록에 있는 핫 네임 중 하나였지만 이러한 시도 중 어느 것도 성공하지 못했습니다. 1985년까지 중국 대만 출신의 중국 과학자 Lin Fukun은 인간 EPO의 유전자를 복제한 후 DNA 재조합 기술을 사용하여 합성 EPO 생산을 실현했습니다.

재조합 인간 EPO는 내인성 EPO 단백질과 동일한 서열을 가지며 유사한 글리코실화 변형을 갖는다. 당연히, 재조합 인간 EPO도 내인성 EPO의 활성을 갖는다. 1989년 6월 Amgen의 첫 번째 제품인 재조합 인간 에리트로포이에틴 Epogen은 만성 신부전으로 인한 빈혈 치료용으로, HIV 감염 치료용 빈혈용으로 미국 FDA의 승인을 받았습니다. Epogen 매출은 단 3개월 만에 1,600만 달러를 넘어섰습니다. 이후 20년 동안 Amgen은 재조합 인간 EPO 시장을 지배했습니다. Epogen은 2010년에만 Amgen에 25억 달러의 매출을 올렸습니다. 2018년 암젠의 주식 시장 가치는 1,288억 달러로 세계에서 8번째로 큰 제약 회사가 되었습니다.

Amgen은 처음에 Goldwasser와 협력하여 시퀀싱을 위한 정제된 인간 EPO 단백질을 제공했지만 Goldwasser와 Amgen은 이데올로기적 차이로 인해 곧 탈락했습니다. 기초 연구를 수행한 Goldwasser와 그의 시카고 대학은 그가 발견한 호르몬에 대한 특허를 생각한 적이 없었기 때문에 EPO의 엄청난 상업적 성공에 대해 한 푼도 받지 못했습니다.

그것은 -- 그것이 어떻게 자극제입니까?

우리가 숨을 쉴 때 산소는 세포의 미토콘드리아로 들어가 호흡 사슬을 구동하고 우리 몸의 주요 에너지원인 ATP를 대량 생산합니다. 빈혈이 있는 사람은 건강한 적혈구가 충분하지 않으며, 가장 즉각적인 영향은 충분한 산소를 섭취하지 않아 장기적으로 호흡 문제와 유사하게 피곤함을 느끼게 됩니다. 재조합 인간 EPO를 주입하면 빈혈 환자의 몸에서 더 많은 적혈구가 생성되고,더 많은 산소를 운반하고 더 많은 에너지 분자 ATP를 생성하여 증상을 효과적으로 완화합니다.

그러나 일부 스포츠 종사자들도 재조합 인간 EPO를 생각하기 시작했습니다. EPO 유형의 인공 재조합 호르몬을 사용하여 운동 선수의 신체를 자극하여 더 많은 적혈구를 생성하면 운동 선수의 산소 획득 및 에너지 분자 생산 능력을 향상시킬 수 있으며 이는 운동 선수의 지구력 향상에도 기여할 수 있습니다. 사이클링, 장거리 달리기, 크로스컨트리 스키와 같은 이벤트. 응용 생리학 저널(Journal of Applied Physiology)의 1980년 논문에 따르면 혈액 자극제(에리스로포이에틴, 인공 산소 운반체 및 수혈)가 지구력을 34% 증가시킬 수 있다고 합니다. 운동선수가 EPO를 사용하면 이전보다 44초 단축된 시간에 러닝머신에서 8km를 달릴 수 있습니다. 사실, 자전거 타기와 마라톤은 EPO 각성제에 대한 최악의 위반자였습니다. 1998년 투르 드 프랑스에서 Festina 팀의 스페인 팀 의사가 인공 재조합 EPO 400병을 가지고 프랑스 국경에서 체포되었습니다! 물론 결과는 팀 전체가 투어에서 쫓겨나고 금지되었습니다.

국제 올림픽 위원회는 1992년 바르셀로나 올림픽에서 EPO를 금지 목록에 추가했지만 인간 EPO 테스트를 재구성하는 것이 너무 어려웠기 때문에 2000년 올림픽 이전에는 선수들이 EPO를 사용하는지 여부를 효과적으로 감지할 방법이 없었습니다. 몇 가지 이유가 있습니다. 1) 체액의 EPO 함량은 매우 낮고 정상인의 혈액 ml당 EPO는 약 130-230나노그램입니다. 2) 인공 재조합 EPO의 아미노산 조성은 인간의 내인성 EPO 단백질과 정확히 동일하며 당화 형태만 약간 다릅니다. 3) EPO의 혈중 반감기는 5~6시간에 불과하며, 일반적으로 마지막 주사 후 4~7일이 지나면 감지할 수 없습니다. 4) 개별 EPO 수준이 매우 다르기 때문에 절대적인 정량적 기준을 수립하기 어렵다.

2000년부터 WADA는 재조합 EPO를 직접 검출하기 위한 유일한 과학적 검증 방법으로 소변 검사를 사용해 왔습니다. 인공 재조합 EPO의 글리코실화된 형태와 인간 EPO의 글리코실화된 형태 사이의 약간의 차이로 인해 두 분자의 하전 특성이 매우 작고 등전점 포커싱이라는 전기영동 방법으로 구별할 수 있습니다. 인공 재조합 EPO의 직접 검출. 그러나 인간 유래 세포에서 발현되는 일부 재조합 EPO는 글리코실화에 차이가 없었기 때문에 일부 전문가들은 외인성 EPO와 내인성 EPO를 탄소 동위원소 함량이 다른 것으로 구분해야 한다고 제안했다.

사실, EPO에 대한 다양한 테스트 방법에는 여전히 한계가 있습니다. 예를 들어, 미국의 사이클링 전설인 Lance Armstrong은 투르 드 프랑스에서 7번 우승하는 동안 EPO와 기타 각성제를 복용한 사실을 인정했지만 당시 어떤 도핑 테스트에서도 실제로 EPO 양성 반응이 확인되지는 않았습니다. 우리는 여전히 "한 발 더 높은지" 또는 "한 발 더 높은지"를 기다려야 합니다.

노벨상은 어떻게 만들까

EPO와 2019년 노벨 생리의학상의 연관성에 대한 마지막 말씀.

EPO는 저산소증에 대한 인체의 지각과 반응의 가장 대표적인 경우이다. 따라서 두 명의 노벨상 수상자인 Semenza와 Ratcliffe는 저산소증에 대한 세포 인식 및 적응 메커니즘을 연구하기 위한 출발점으로 EPO를 선택했습니다. 첫 번째 단계는 산소 변화에 반응할 수 있는 EPO 유전자의 요소를 찾는 것이었다. Semenza는 저산소증 반응 요소로 명명된 EPO를 암호화하는 유전자의 3' 하류 말단에서 주요 256-염기 비암호화 서열을 확인하였다. 이 요소 서열이 돌연변이되거나 삭제되면 저산소증에 반응하는 EPO 단백질의 능력이 크게 감소합니다. 이 요소 서열이 저산소증과 관련되지 않은 다른 유전자의 다운스트림 3' 말단에 융합되면, 이러한 변형된 유전자도 EPO 유사 활성화를 나타냅니다.저산소 상태에서.

그런 다음 Ratcliffe와 그의 팀은 이 저산소 반응 요소가 EPO 생산을 담당하는 신장이나 간 세포뿐만 아니라 저산소 상태에서 기능할 수 있는 다른 많은 세포 유형에도 존재한다는 사실을 발견했습니다. 즉, 저산소증에 대한 이러한 반응은 EPO에 특이적인 것이 아니라 세포에서 더 널리 퍼진 현상일 수 있습니다. EPO 생산을 담당하지 않는 이러한 다른 세포는 산소 농도의 변화를 감지하고 저산소 반응 요소에 결합하여 EPO와 같은 유전자를 작동시키는 분자(예: 유전자 발현을 담당하는 전사 인자)를 포함해야 합니다.