Trys 2019 m. Nobelio fiziologijos ar medicinos premijos laureatai Williamas G. Kaelinas jaunesnysis, Greggas L. Semenza ir seras Peteris J. Ratcliffe'as jau laimėjo 2016 m. Laskerio premiją pagrindinėje medicinoje už darbą, kaip ląstelės jaučia ir prisitaiko. iki hipoksijos, todėl tai nenustebino. Jie atrado ir nustatė pagrindinės molekulės hipoksijos sukeliamą faktorių 1 (HIF-1). Šiandien norime grįžti prie tyrimo ištakų – eritropoetino arba EPO – stebuklingos molekulės.

Tai svarbiausias raudonųjų kraujo kūnelių gamybos veiksnys

Raudonieji kraujo kūneliai yra gausiausia kraujo kūnelių rūšis kraujyje ir yra pagrindinė terpė pernešti deguonį ir anglies dioksidą per stuburinių gyvūnų kraują. Kaulų čiulpuose susidaro eritrocitai: kraujodaros kamieninės ląstelės pirmiausia dauginasi ir diferencijuojasi į įvairių kraujo ląstelių pirmtakus, o eritroidiniai pirmtakai gali toliau diferencijuotis ir bręsti į eritrocitus. Normaliomis sąlygomis žmogaus eritrocitų gamybos greitis yra labai mažas, tačiau esant stresui, pavyzdžiui, kraujavimui, hemolizei ir hipoksijai, eritrocitų gamybos greitis gali padidėti iki aštuonių kartų. Šiame procese eritropoetinas EPO yra vienas iš svarbiausių veiksnių.

EPO yra hormonas, sintetinamas daugiausia inkstuose. Jo cheminė prigimtis yra labai glikozilintas baltymas. Kodėl inkstuose? Kas minutę pro inkstus nuteka apie litrą kraujo, todėl jie gali greitai ir efektyviai nustatyti deguonies kiekio kraujyje pokyčius. Kai deguonies kiekis kraujyje yra mažas, inkstai greitai reaguoja ir gamina didelius EPO kiekius. Pastarasis per kraują cirkuliuoja į kaulų čiulpus, kur skatina eritroidinių pirmtakų pavertimą raudonaisiais kraujo kūneliais. Subrendę raudonieji kraujo kūneliai iš kaulų čiulpų patenka į kraujotakos sistemą, kad pagerintų organizmo gebėjimą prisijungti prie deguonies. Kai inkstai jaučia deguonies padidėjimą kraujyje, jie sumažina EPO gamybą, o tai savo ruožtu sumažina raudonųjų kraujo kūnelių kiekį kaulų čiulpuose.

Tai sukuria tobulą reguliavimo kilpą. Tačiau žmonės, gyvenantys dideliame aukštyje ir kai kurie sergantys anemija, dažnai susiduria su nuolat mažo deguonies kiekio kraujyje būkle, kuri negali užbaigti minėtos kraujotakos ir paskatinti inkstus nuolat išskirti EPO, todėl EPO koncentracija kraujyje yra didesnė nei paprastų žmonių.

Jai atskleisti prireikė beveik 80 metų

Kaip ir daugelis pagrindinių atradimų, mokslininkų supratimas apie EPO nebuvo sklandus, kelyje kilo klausimų ir iššūkių. Nuo EPO koncepcijos iki galutinio konkrečios molekulės nustatymo praėjo beveik 80 metų.

1906 m. prancūzų mokslininkai Carnot ir Deflandre suleido normaliems triušiams aneminių triušių serumo ir nustatė, kad raudonųjų kraujo kūnelių skaičius normalių triušių plazmoje padidėjo. Jie tikėjo, kad kai kurie humoraliniai plazmos veiksniai gali paskatinti ir reguliuoti raudonųjų kraujo kūnelių gamybą. Tai buvo pirmasis EPO koncepcijos prototipas. Deja, vėlesniais dešimtmečiais rezultatai nebuvo pakartoti, daugiausia dėl to, kad naujų raudonųjų kraujo kūnelių skaičius nebuvo tikslus.

Reissmanno ir Ruhenstroth-Bauerio parabiozės eksperimentas 1950 m. pateikė tikrai svarių įrodymų. Jie chirurginiu būdu sujungė dviejų gyvų žiurkių kraujotakos sistemas, vieną pastatydami į hipoksinę aplinką, o kitą kvėpuodami normaliu oru. Dėl to abi pelės gamino didžiulius kiekius raudonųjų kraujo kūnelių. Neabejotina, kad kraujyje yra hormono, skatinančio raudonųjų kraujo kūnelių gamybą, nuo kurio ir kilo EPO pavadinimas. Kita vertus, EPO yra labai jautrus hipoksijai.

Kokia molekulė yra EPO? Amerikiečių mokslininkui Goldwasseriui prireikė 30 metų, kol galiausiai išaiškino problemą biocheminiu lygmeniu. Jei darbuotojas nori atlikti gerą darbą, pirmiausia jis turi pagaląsti įrankius. EPO funkcija yra stimuliuoti naujus raudonuosius kraujo kūnelius, betpastarųjų skaičius nėra tikslus. Svarbiausia raudonųjų kraujo kūnelių funkcinė molekulė yra hemoglobino turintis hemas, kurio centre yra geležies jonas. Taigi Goldwassero komanda naujagimių raudonuosius kraujo kūnelius paženklino radioaktyviais geležies izotopais ir sukūrė jautrų metodą EPO aktyvumui nustatyti. Tai leidžia išskirti ir išvalyti labai mažas EPO koncentracijas (nanogramas mililitre) iš gyvūnų skysčių mėginių. Tačiau EPO izoliuoti buvo labai sunku. Jie perėjo nuo inkstų prie aneminės avių plazmos, prie pacientų, kuriems buvo sunkus geležies trūkumas dėl kabliukų infekcijos, šlapimą ir galiausiai, 1977 m., iš 2550 litrų šlapimo iš Japonijos pacientų, sergančių aplastine anemija, išgrynino 8 miligramus žmogaus EPO baltymo.

1985 m. buvo baigtas žmogaus EPO baltymų sekos nustatymas ir genų klonavimas. EPO genas koduoja 193 amino likučius turintį polipeptidą, kuris po signalinio peptido nukirpimo sekrecijos metu tampa subrendusiu baltymu, susidedančiu iš 166 aminorūgščių liekanų, ir jame yra 4 glikozilinimo modifikavimo vietos. 1998 m. buvo ištirta EPO BMR tirpalo struktūra ir EPO bei jo receptorių komplekso kristalinė struktūra. Šiuo metu žmonės intuityviausiai supranta EPO.

Iki šiol anemijai gydyti dažniausiai reikėdavo perpilti kraują, kad būtų kompensuotas raudonųjų kraujo kūnelių trūkumas. Žmonėms daugiau sužinojus apie EPO, jo suleidimas, siekiant paskatinti raudonųjų kraujo kūnelių gamybą savo kaulų čiulpuose, palengvino problemą. Tačiau išvalyti EPO tiesiai iš kūno skysčių, kaip tai padarė Goldwasseris, sunku, o derlius yra mažas. EPO baltymo ir genų sekos nustatymas leido pagaminti rekombinantinį žmogaus EPO dideliais kiekiais.

Tai padarė biotechnologijų įmonė, vadinama Applied Molecular Genetics (Amgen). „Amgen“ buvo įkurta 1980 m., turėdama tik septynis narius, tikėdamasi gaminti biofarmacinius preparatus naudojant tuo metu atsirandančius molekulinės biologijos metodus. Interferonas, augimo hormoną atpalaiduojantis faktorius, hepatito B vakcina, epidermio augimo faktorius buvo tarp populiariausių pavadinimų jų taikinių sąraše, tačiau nė vienas iš šių bandymų nebuvo sėkmingas. Iki 1985 m. Linas Fukunas, Kinijos mokslininkas iš Taivano (Kinija), klonavo žmogaus EPO geną, o vėliau įgyvendino sintetinio EPO gamybą, naudodamas DNR rekombinacijos technologiją.

Rekombinantinis žmogaus EPO turi tokią pačią seką kaip endogeninis EPO baltymas, taip pat turi panašią glikozilinimo modifikaciją. Natūralu, kad rekombinantinis žmogaus EPO taip pat turi endogeninio EPO aktyvumą. 1989 m. birželį JAV FDA patvirtino pirmąjį Amgen produktą – rekombinantinį žmogaus eritropoetiną Epogen, skirtą anemijai, kurią sukelia lėtinis inkstų nepakankamumas, ir ŽIV infekcijos gydymo anemijai gydyti. Vos per tris mėnesius Epogen pardavimai viršijo 16 mln. Per ateinančius du dešimtmečius Amgen dominavo surinktų žmogaus EPO rinkoje. „Epogen“ vien 2010 m. atnešė „Amgen“ 2,5 mlrd. USD pajamų. 2018 m. „Amgen“ akcijų rinkos vertė buvo 128,8 mlrd. USD, todėl ji buvo aštunta pagal dydį farmacijos įmonė pasaulyje.

Verta paminėti, kad Amgen iš pradžių dirbo su Goldwasser, kad gautų išgrynintus žmogaus EPO baltymus sekos nustatymui, tačiau netrukus Goldwasser ir Amgen išsiskyrė dėl ideologinių skirtumų. Goldwasseris ir jo Čikagos universitetas, kuris atliko pagrindinius tyrimus, niekada negalvojo patentuoti jo atrasto hormono, todėl negavo nė cento už didžiulę EPO komercinę sėkmę.

Tai – kaip tai stimuliatorius

Kai kvėpuojame, deguonis patenka į ląstelių mitochondrijas, kad valdytų kvėpavimo grandinę ir pagamintų didžiulius kiekius ATP, pagrindinio mūsų kūno energijos šaltinio. Anemija sergantys žmonės neturi pakankamai sveikų raudonųjų kraujo kūnelių, o tiesioginis poveikis yra tai, kad jie nepasisavina pakankamai deguonies, todėl jie jaučiasi pavargę, panašiai kaip kvėpavimo sutrikimai ilgą laiką. Sušvirkštus rekombinantinio žmogaus EPO, anemija sergančių pacientų organizmas gamina daugiau raudonųjų kraujo kūnelių,perneša daugiau deguonies ir gamina daugiau energijos molekulės ATP, veiksmingai malšindamos simptomus.

Tačiau kai kurie sporto darbuotojai taip pat pradėjo galvoti apie rekombinantinį žmogaus EPO. Jei EPO tipo dirbtinis rekombinantinis hormonas yra naudojamas stimuliuoti sportininkų organizmą gaminti daugiau raudonųjų kraujo kūnelių, galima pagerinti sportininkų gebėjimą gauti deguonį ir gaminti energijos molekules, kurios taip pat gali pagerinti sportininkų ištvermės rezultatus. tokius renginius kaip važiavimas dviračiu, ilgų nuotolių bėgimas ir lygumų slidinėjimas. 1980 m. žurnale „Journal of Applied Physiology“ paskelbtas straipsnis parodė, kad kraujo stimuliatoriai (eritropoetinas, dirbtiniai deguonies nešikliai ir kraujo perpylimas) gali padidinti ištvermę 34 proc. Jei sportininkai naudoja EPO, jie gali nubėgti 8 kilometrus bėgimo takeliu per 44 sekundėmis trumpesnį laiką nei anksčiau. Tiesą sakant, dviračių sportas ir maratonai buvo didžiausi EPO stimuliatorių pažeidėjai. 1998 m. Tour de France metu prie Prancūzijos sienos buvo areštuotas Ispanijos komandos gydytojas Festina komandai su 400 butelių dirbtinio rekombinantinio EPO! Rezultatas, žinoma, buvo toks, kad visa komanda buvo pašalinta iš turo ir uždrausta.

Tarptautinis olimpinis komitetas įtraukė EPO į savo draudžiamų sąrašą 1992 m. Barselonos žaidynėse, tačiau pertvarkyti žmogaus EPO testavimą buvo taip sunku, kad prieš 2000 m. žaidynes nebuvo jokio būdo veiksmingai nustatyti, ar sportininkai jį naudoja. Priežastys yra kelios: 1) EPO kiekis kūno skysčiuose yra labai mažas, o EPO vienam ml kraujo normalių žmonių yra apie 130-230 nanogramų; 2) Dirbtinio rekombinantinio EPO aminorūgščių sudėtis yra lygiai tokia pati kaip žmogaus endogeninio EPO baltymo, tik glikozilinimo forma labai nežymiai skiriasi; 3) EPO pusinės eliminacijos laikas kraujyje yra tik 5-6 valandos, o po paskutinės injekcijos jis paprastai neaptinkamas 4-7 dienas; 4) Individualus EPO lygis labai skiriasi, todėl sunku nustatyti absoliutų kiekybinį standartą.

Nuo 2000 m. WADA naudoja šlapimo tyrimus kaip vienintelį mokslinio patikrinimo metodą, skirtą tiesiogiai aptikti rekombinantinį EPO. Dėl nedidelių skirtumų tarp dirbtinio rekombinantinio EPO ir žmogaus EPO glikoilintos formos šių dviejų molekulių įkrautos savybės yra labai mažos ir jas galima atskirti taikant elektroforezės metodą, vadinamą izoelektriniu fokusavimu, kuris yra pagrindinė tiesioginis dirbtinio rekombinantinio EPO aptikimas. Tačiau kai kurie rekombinantiniai EPO, ekspresuojami iš žmogaus gautų ląstelių, neparodė glikozilinimo skirtumo, todėl kai kurie ekspertai pasiūlė, kad egzogeninis EPO ir endogeninis EPO turėtų būti atskirti pagal skirtingą anglies izotopų kiekį.

Tiesą sakant, skirtingi EPO bandymo metodai vis dar yra riboti. Pavyzdžiui, amerikiečių dviračių sporto legenda Lance'as Armstrongas prisipažino vartojęs EPO ir kitus stimuliatorius per savo septynias „Tour de France“ pergales, tačiau tuo metu jo EPO nebuvo patvirtinta jokiame dopingo teste. Dar reikia palaukti ir pažiūrėti, ar jis „viena koja aukščiau“, ar „viena koja aukščiau“.

Kaip tai daro Nobelio premiją

Paskutinis žodis apie ryšį tarp EPO ir 2019 m. Nobelio fiziologijos ar medicinos premijos.

EPO yra tipiškiausias žmogaus organizmo suvokimo ir reakcijos į hipoksiją atvejis. Todėl Semenza ir Ratcliffe, du Nobelio premijos laureatai, pasirinko EPO kaip atspirties tašką tirdami ląstelių suvokimo ir prisitaikymo prie hipoksijos mechanizmą. Pirmasis žingsnis buvo rasti EPO geno elementus, kurie galėtų reaguoti į deguonies pokyčius. Semenza nustatė pagrindinę 256 bazių nekoduojančią seką EPO koduojančio geno 3' gale, pavadintą hipoksijos atsako elementu. Jei ši elementų seka yra mutavusi arba pašalinta, EPO baltymo gebėjimas reaguoti į hipoksiją labai sumažėja. Jei ši elementų seka yra sujungta su kitų genų, nesusijusių su hipoksija, 3' galu, šie modifikuoti genai taip pat rodo į EPO panašų aktyvavimą.hipoksijos sąlygomis.

Tada Ratcliffe'as ir jo komanda atrado, kad šis hipoksinio atsako elementas yra ne tik inkstų ar kepenų ląstelėse, atsakingose ​​už EPO gamybą, bet ir daugelyje kitų ląstelių tipų, kurios gali veikti hipoksinėmis sąlygomis. Kitaip tariant, šis atsakas į hipoksiją gali būti ne specifinis EPO, o labiau paplitęs reiškinys ląstelėse. Šiose kitose ląstelėse, kurios nėra atsakingos už EPO gamybą, turi būti molekulių (pvz., transkripcijos faktorių, atsakingų už genų ekspresijos įjungimą), kurios jaučia deguonies koncentracijos pokyčius ir prisijungia prie hipoksinio atsako elementų, kad įjungtų tokius genus kaip EPO.