Trīs 2019. gada Nobela prēmijas fizioloģijā vai medicīnā laureāti, Viljams G. Keels, jaunākais, Gregs L. Semenca un sers Pīters J. Retklifs jau bija ieguvuši 2016. gada Laskera balvu pamata medicīnā par darbu pie šūnu uztveres un pielāgošanās. līdz hipoksijai, tāpēc tas nebija īpaši pārsteidzoši. Viņi atklāja un identificēja galvenās molekulas hipoksijas izraisīto faktoru 1 (HIF-1). Šodien mēs vēlamies atgriezties pie pētījuma sākuma, kas ir eritropoetīns jeb EPO, brīnummolekula.
Tas ir vissvarīgākais sarkano asins šūnu ražošanas faktors
Sarkanās asins šūnas ir visizplatītākais asins šūnu veids asinīs, un tas ir galvenais līdzeklis skābekļa un oglekļa dioksīda transportēšanai caur mugurkaulnieku asinīm. Eritrocīti veidojas kaulu smadzenēs: asinsrades cilmes šūnas vispirms vairojas un diferencējas par dažādu asins šūnu priekštečiem, un eritroīdie cilmes šūnas var tālāk diferencēties un nobriest eritrocītos. Normālos apstākļos cilvēka eritrocītu veidošanās ātrums ir ļoti zems, bet stresa apstākļos, piemēram, asiņošana, hemolīze un hipoksija, eritrocītu veidošanās ātrumu var palielināt līdz pat astoņām reizēm. Šajā procesā eritropoetīna EPO ir viens no svarīgākajiem faktoriem.
EPO ir hormons, ko galvenokārt sintezē nierēs. Tā ķīmiskā būtība ir ļoti glikozilēts proteīns. Kāpēc nierēs? Katru minūti caur nierēm izplūst aptuveni litrs asiņu, tāpēc tās var ātri un efektīvi noteikt skābekļa līmeņa izmaiņas asinīs. Ja skābekļa līmenis asinīs ir zems, nieres ātri reaģē un ražo lielu daudzumu EPO. Pēdējais pa asinsriti cirkulē uz kaulu smadzenēm, kur tas veicina eritroīdu cilmes šūnu pārvēršanos sarkanās asins šūnās. Nobriedušas sarkanās asins šūnas no kaulu smadzenēm tiek atbrīvotas asinsrites sistēmā, lai uzlabotu organisma spēju saistīties ar skābekli. Kad nieres jūt skābekļa palielināšanos asinīs, tās samazina EPO veidošanos, kas savukārt samazina sarkano asins šūnu daudzumu kaulu smadzenēs.
Tas veido perfektu regulēšanas cilpu. Tomēr cilvēki, kas dzīvo lielā augstumā, un daži anēmijas pacienti bieži saskaras ar nepārtraukti zemu skābekļa līmeni asinīs, kas nevar pabeigt iepriekš minēto cirkulāciju un stimulēt nieres nepārtraukti izdalīt EPO, tādējādi EPO koncentrācija asinīs ir augstāka nekā parastajiem cilvēkiem.
Lai to atklātu, bija vajadzīgi gandrīz 80 gadi
Tāpat kā daudzi nozīmīgi atklājumi, zinātnieku izpratne par EPO nav bijusi gluda, un ceļā ir radušies jautājumi un izaicinājumi. No EPO koncepcijas līdz konkrētas molekulas galīgai noteikšanai pagāja gandrīz 80 gadi.
1906. gadā franču zinātnieki Carnot un Deflandre injicēja normāliem trušiem ar anēmisku trušu serumu un atklāja, ka sarkano asins šūnu skaits normālu trušu plazmā palielinās. Viņi uzskatīja, ka daži humorālie faktori plazmā var stimulēt un regulēt sarkano asins šūnu veidošanos. Šis bija pirmais EPO koncepcijas prototips. Diemžēl turpmākajās desmitgadēs rezultāti nav atkārtoti, galvenokārt tāpēc, ka jauno sarkano asins šūnu skaits nebija precīzs.
Reismana un Ruhenstrota-Bauera parabiozes eksperiments 1950. gadā sniedza patiešām spēcīgus pierādījumus. Viņi ķirurģiski savienoja divu dzīvo žurku asinsrites sistēmas, vienu ievietojot hipoksiskā vidē, bet otru elpojot normālu gaisu. Rezultātā abas peles ražoja milzīgu daudzumu sarkano asins šūnu. Nav šaubu, ka asinsritē ir hormons, kas stimulē sarkano asinsķermenīšu veidošanos, no kā arī EPO cēlies nosaukums. No otras puses, EPO ir ļoti jutīgs pret hipoksiju.
Kāda molekula ir EPO? Amerikāņu zinātniekam Goldvaseram vajadzēja 30 gadus, lai beidzot noskaidrotu problēmu bioķīmiskā līmenī. Ja strādnieks vēlas darīt labu darbu, viņam vispirms ir jāuzasina instrumenti. EPO funkcija ir stimulēt jaunu sarkano asins šūnu, betpēdējo skaits nav precīzs. Sarkano asinsķermenīšu svarīgākā funkcionālā molekula ir hemoglobīnu saturošais hēms, kura centrā ir dzelzs jons. Tātad Goldwassera komanda marķēja jaundzimušos sarkanās asins šūnas ar radioaktīviem dzelzs izotopiem un izstrādāja jutīgu metodi EPO aktivitātes noteikšanai. Tas ļauj izolēt un attīrīt ļoti zemas EPO koncentrācijas (nanogrammas mililitrā) no dzīvnieku šķidruma paraugiem. Taču EPO izolēšana bija ārkārtīgi sarežģīta. Viņi pārgāja no nierēm uz anēmisku aitu plazmu, uz urīnu pacientiem ar smagu dzelzs deficītu āķtārpu infekcijas dēļ un visbeidzot 1977. gadā attīrīja 8 miligramus cilvēka EPO proteīna no 2550 litriem urīna no Japānas pacientiem ar aplastisko anēmiju.
1985. gadā tika pabeigta cilvēka EPO proteīnu sekvencēšana un gēnu klonēšana. EPO gēns kodē polipeptīdu ar 193 amino atlikumiem, kas kļūst par nobriedušu proteīnu, kas sastāv no 166 aminoskābju atlikumiem pēc signālpeptīda nogriešanas sekrēcijas laikā, un satur 4 glikozilācijas modifikācijas vietas. 1998. gadā tika analizēta EPO KMR šķīduma struktūra un EPO un tā receptoru kompleksa kristāliskā struktūra. Šajā brīdī cilvēkiem ir visintuitīvākā izpratne par EPO.
Līdz šim anēmijas ārstēšanai parasti bija nepieciešama asins pārliešana, lai papildinātu sarkano asins šūnu deficītu. Tā kā cilvēki uzzina vairāk par EPO, tā injicēšana, lai stimulētu sarkano asins šūnu veidošanos viņu pašu kaulu smadzenēs, ir atvieglojusi problēmu. Taču EPO attīrīšana tieši no ķermeņa šķidrumiem, kā to darīja Goldvasers, ir sarežģīta, un raža ir zema. EPO proteīna un gēnu secības noteikšana ļāva ražot rekombinanto cilvēka EPO lielos daudzumos.
To veica biotehnoloģiju uzņēmums Applied Molecular Genetics (Amgen). Uzņēmums Amgen tika dibināts 1980. gadā ar tikai septiņiem dalībniekiem, cerot ražot biofarmaceitiskos produktus, izmantojot tobrīd jaunās molekulārās bioloģijas metodes. Interferons, augšanas hormonu atbrīvojošais faktors, B hepatīta vakcīna, epidermas augšanas faktors bija viens no populārākajiem nosaukumiem viņu mērķu sarakstā, taču neviens no šiem mēģinājumiem nebija veiksmīgs. Līdz 1985. gadam ķīniešu zinātnieks Lins Fukuns no Taivānas, Ķīnas, klonēja cilvēka EPO gēnu un pēc tam realizēja sintētiskā EPO ražošanu, izmantojot DNS rekombinācijas tehnoloģiju.
Rekombinantajam cilvēka EPO ir tāda pati secība kā endogēnajam EPO proteīnam, un tam ir arī līdzīga glikozilācijas modifikācija. Protams, rekombinantajam cilvēka EPO ir arī endogēnā EPO aktivitāte. 1989. gada jūnijā ASV FDA apstiprināja Amgen pirmo produktu, rekombinanto cilvēka eritropoetīnu Epogen, hroniskas nieru mazspējas izraisītas anēmijas ārstēšanai un anēmijas ārstēšanai HIV infekcijas ārstēšanā. Epogen pārdošanas apjomi pārsniedza 16 miljonus USD tikai trīs mēnešu laikā. Nākamajās divās desmitgadēs Amgen dominēja pārmontētā cilvēka EPO tirgū. Epogen 2010. gadā vien Amgen atnesa ieņēmumus 2,5 miljardu dolāru apmērā. 2018. gadā Amgen akciju tirgus vērtība bija 128,8 miljardi ASV dolāru, padarot to par astoto lielāko farmācijas uzņēmumu pasaulē.
Ir vērts atzīmēt, ka Amgen sākotnēji strādāja ar Goldwasser, lai nodrošinātu attīrītus cilvēka EPO proteīnus sekvencēšanai, bet Goldwasser un Amgen drīz vien izkrita ideoloģisko atšķirību dēļ. Goldvasers un viņa Čikāgas Universitāte, kas veica fundamentālos pētījumus, nekad nedomāja patentēt viņa atklāto hormonu, un tāpēc nav saņēmuši ne santīma par EPO milzīgajiem komerciālajiem panākumiem.
Tas - kā tas ir stimulants
Kad mēs elpojam, skābeklis nonāk šūnu mitohondrijās, lai vadītu elpošanas ķēdi un ražotu milzīgu daudzumu ATP, kas ir galvenais enerģijas avots mūsu ķermenī. Anēmiskiem cilvēkiem nav pietiekami daudz veselīgu sarkano asins šūnu, un vistiešākā ietekme ir tāda, ka viņi neuzņem pietiekami daudz skābekļa, kas liek viņiem justies nogurušam, līdzīgi kā elpošanas problēmām ilgstošas skrējiena laikā. Injicējot rekombinanto cilvēka EPO, anēmijas pacientu organisms ražo vairāk sarkano asins šūnu,pārvadā vairāk skābekļa un ražo vairāk enerģijas molekulas ATP, efektīvi mazinot simptomus.
Tomēr daži sporta darbinieki ir sākuši domāt arī par rekombinanto cilvēka EPO. Ja tiek izmantots mākslīgais EPO tipa rekombinantais hormons, lai stimulētu sportistu organismu ražot vairāk sarkano asins šūnu, iespējams uzlabot sportistu spēju iegūt skābekli un ražot enerģijas molekulas, kas var uzlabot arī sportistu sniegumu izturībā. tādiem pasākumiem kā riteņbraukšana, garo distanču skriešana un distanču slēpošana. 1980. gada raksts Journal of Applied Physiology parādīja, ka asins stimulanti (eritropoetīns, mākslīgie skābekļa nesēji un asins pārliešana) var palielināt izturību par 34 procentiem. Ja sportisti izmanto EPO, viņi var noskriet 8 kilometrus uz skrejceļa par 44 sekundēm īsākā laikā nekā iepriekš. Patiesībā riteņbraukšana un maratoni ir bijuši vissliktākie EPO stimulantu pārkāpēji. 1998. gada Tour de France laikā Spānijas komandas ārsts Festina komandai tika arestēts uz Francijas robežas ar 400 pudelēm mākslīgā rekombinantā EPO! Rezultāts, protams, bija tāds, ka visa komanda tika izslēgta no tūres un tika aizliegta.
Starptautiskā Olimpiskā komiteja 1992. gada Barselonas spēlēs iekļāva EPO savā aizliegtajā sarakstā, taču cilvēku EPO testēšanas reorganizācija bija tik sarežģīta, ka pirms 2000. gada spēlēm nebija iespējams efektīvi noteikt, vai sportisti to lieto. Ir vairāki iemesli: 1) EPO saturs ķermeņa šķidrumos ir ļoti zems, un EPO uz ml asiņu normāliem cilvēkiem ir aptuveni 130-230 nanogrami; 2) mākslīgā rekombinantā EPO aminoskābju sastāvs ir tieši tāds pats kā cilvēka endogēnajam EPO proteīnam, tikai glikozilācijas forma ir ļoti nedaudz atšķirīga; 3) EPO pussabrukšanas periods asinīs ir tikai 5-6 stundas, un tas parasti nav nosakāms 4-7 dienas pēc pēdējās injekcijas; 4) Individuālais EPO līmenis ir ļoti atšķirīgs, tāpēc ir grūti noteikt absolūtu kvantitatīvu standartu.
Kopš 2000. gada WADA ir izmantojusi urīna testēšanu kā vienīgo zinātniskās verifikācijas metodi rekombinantā EPO tiešai noteikšanai. Sakarā ar nelielām atšķirībām starp mākslīgā rekombinantā EPO glikoilēto formu un cilvēka EPO glikoilēto formu, abu molekulu uzlādētās īpašības ir ļoti mazas un tās var atšķirt ar elektroforēzes metodi, ko sauc par izoelektrisko fokusēšanu, kas ir galvenā EPO stratēģija. mākslīgā rekombinantā EPO tieša noteikšana. Tomēr daži rekombinantie EPO, ko ekspresē cilvēka atvasinātās šūnas, neuzrādīja atšķirības glikozilācijā, tāpēc daži eksperti ierosināja, ka eksogēnais EPO un endogēnais EPO jāatšķir ar atšķirīgu oglekļa izotopu saturu.
Faktiski dažādās EPO testēšanas metodēs joprojām ir ierobežojumi. Piemēram, amerikāņu riteņbraukšanas leģenda Lenss Ārmstrongs atzina, ka septiņu Tour de France uzvaru laikā lietojis EPO un citus stimulantus, taču tajā laikā viņam netika apstiprināts EPO pozitīvs nevienā dopinga pārbaudē. Mums vēl jāpagaida un jāskatās, vai tas ir "vienu pēdu augstāks" vai "vienu pēdu augstāks".
Kā tas veido Nobela prēmiju
Pēdējais vārds par saistību starp EPO un 2019. gada Nobela prēmiju fizioloģijā vai medicīnā.
EPO ir tipiskākais cilvēka ķermeņa uztveres un reakcijas uz hipoksiju gadījums. Tāpēc Semenza un Retklifs, divi Nobela prēmijas laureāti, izvēlējās EPO kā sākumpunktu, lai pētītu šūnu uztveres mehānismu un adaptāciju hipoksijai. Pirmais solis bija atrast EPO gēna elementus, kas varētu reaģēt uz skābekļa izmaiņām. Semenza identificēja galveno 256 bāzu nekodējošu secību gēna, kas kodē EPO, 3' lejup pa straumi, ko nosauca par hipoksijas reakcijas elementu. Ja šī elementa secība ir mutēta vai izdzēsta, EPO proteīna spēja reaģēt uz hipoksiju ir ievērojami samazināta. Ja šī elementa secība ir sapludināta ar citu ar hipoksiju nesaistītu gēnu lejpus 3' galu, šie modificētie gēni arī parāda EPO līdzīgu aktivāciju.hipoksijas apstākļos.
Pēc tam Ratcliffe un viņa komanda atklāja, ka šis hipoksiskās reakcijas elements atrodas ne tikai nieru vai aknu šūnās, kas ir atbildīgas par EPO ražošanu, bet arī daudzos citos šūnu veidos, kas var darboties hipoksijas apstākļos. Citiem vārdiem sakot, šī reakcija uz hipoksiju var nebūt specifiska EPO, bet gan plašāk izplatīta parādība šūnās. Šajās pārējās šūnās, kas nav atbildīgas par EPO ražošanu, ir jāsatur molekulas (piemēram, transkripcijas faktori, kas ir atbildīgi par gēnu ekspresijas ieslēgšanu), kas uztver skābekļa koncentrācijas izmaiņas un saistās ar hipoksiskās reakcijas elementiem, lai ieslēgtu gēnus, piemēram, EPO.
