Tiga pemenang Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Perubatan 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza dan Sir Peter J. Ratcliffe telah pun memenangi Hadiah Lasker 2016 dalam Perubatan Asas untuk kerja mereka tentang cara sel merasakan dan menyesuaikan diri kepada hipoksia, jadi ia tidak begitu mengejutkan. Mereka menemui dan mengenal pasti molekul utama faktor hipoksia-inducible 1 (HIF-1). Hari ini kita ingin kembali kepada asal kajian, iaitu erythropoietin, atau EPO, molekul ajaib.

Ia adalah faktor terpenting dalam penghasilan sel darah merah

Sel darah merah adalah jenis sel darah yang paling banyak dalam darah, dan merupakan medium utama untuk mengangkut oksigen dan karbon dioksida melalui darah vertebrata. Eritrosit dijana dalam sumsum tulang: Sel stem hematopoietik mula-mula membiak dan membezakan menjadi progenitor pelbagai sel darah, dan progenitor erythroid boleh terus membezakan dan matang menjadi eritrosit. Dalam keadaan biasa, kadar pengeluaran eritrosit manusia adalah sangat rendah, tetapi di bawah tekanan seperti pendarahan, hemolisis, dan hipoksia, kadar pengeluaran eritrosit boleh ditingkatkan sehingga lapan kali ganda. Dalam proses ini, erythropoietin EPO adalah salah satu faktor yang paling penting.

EPO ialah hormon yang disintesis terutamanya dalam buah pinggang. Sifat kimianya ialah protein yang sangat glikosilasi. Kenapa di buah pinggang? Kira-kira satu liter darah mengalir melalui buah pinggang setiap minit, supaya mereka dapat dengan cepat dan cekap mengesan perubahan dalam tahap oksigen dalam darah. Apabila tahap oksigen dalam darah rendah, buah pinggang bertindak balas dengan cepat dan menghasilkan sejumlah besar EPO. Yang terakhir ini beredar melalui aliran darah ke sumsum tulang, di mana ia menggalakkan penukaran sel progenitor erythroid kepada sel darah merah. Sel darah merah yang matang dilepaskan daripada sumsum tulang ke dalam sistem peredaran darah untuk meningkatkan keupayaan tubuh untuk mengikat oksigen. Apabila buah pinggang merasakan peningkatan oksigen dalam darah, ia mengurangkan pengeluaran EPO, yang seterusnya mengurangkan jumlah sel darah merah dalam sumsum tulang.

Ini menjadikan gelung pelarasan yang sempurna. Walau bagaimanapun, orang yang tinggal di altitud tinggi dan sesetengah pesakit anemia sering menghadapi keadaan tahap oksigen darah yang rendah secara berterusan, yang tidak dapat melengkapkan peredaran di atas dan merangsang buah pinggang untuk terus merembeskan EPO, supaya kepekatan EPO darah lebih tinggi daripada orang biasa.

Ia mengambil masa hampir 80 tahun untuk mendedahkannya

Seperti banyak penemuan utama, pemahaman saintis tentang EPO tidak berjalan lancar, dengan persoalan dan cabaran sepanjang perjalanan. Ia mengambil masa hampir 80 tahun daripada konsep EPO kepada penentuan akhir molekul tertentu.

Pada tahun 1906, saintis Perancis Carnot dan Deflandre menyuntik arnab normal dengan serum arnab anemia dan mendapati jumlah sel darah merah dalam plasma arnab normal meningkat. Mereka percaya bahawa beberapa faktor humoral dalam plasma boleh merangsang dan mengawal pengeluaran sel darah merah. Ini adalah prototaip konsep EPO yang pertama. Malangnya, keputusannya tidak direplikasi dalam dekad berikutnya, terutamanya kerana kiraan sel darah merah baru tidak tepat.

Eksperimen parabiosis Reissmann dan Ruhenstroth-Bauer pada tahun 1950 memberikan bukti yang sangat kuat. Mereka secara pembedahan menghubungkan sistem peredaran darah dua tikus hidup, meletakkan satu dalam persekitaran hipoksik dan yang lain bernafas udara normal. Akibatnya, kedua-dua tikus menghasilkan sejumlah besar sel darah merah. Tidak dinafikan terdapat hormon dalam aliran darah yang merangsang pengeluaran sel darah merah, dari mana EPO mendapat namanya. Sebaliknya, EPO sangat sensitif terhadap hipoksia.

Apakah molekul EPO? Saintis Amerika Goldwasser mengambil masa 30 tahun untuk akhirnya menjelaskan masalah itu di peringkat biokimia. Jika seorang pekerja ingin melakukan kerja dengan baik, dia mesti mengasah peralatannya terlebih dahulu. Fungsi EPO adalah untuk merangsang sel darah merah baru, tetapikiraan yang terakhir tidak tepat. Molekul berfungsi yang paling penting dalam sel darah merah ialah hemoglobin yang mengandungi heme, yang mengandungi ion ferus di tengahnya. Jadi pasukan Goldwasser melabelkan sel darah merah yang baru lahir dengan isotop besi radioaktif dan membangunkan kaedah sensitif untuk mengesan aktiviti EPO. Ini memungkinkan untuk mengasingkan dan membersihkan kepekatan EPO (nanogram per mililiter) yang sangat rendah daripada sampel cecair haiwan. Tetapi pengasingan EPO amat sukar. Mereka bertukar daripada plasma kambing biri-biri daripada buah pinggang ke anemia, kepada air kencing pesakit yang mengalami kekurangan zat besi yang teruk akibat jangkitan cacing tambang, dan akhirnya, pada tahun 1977, membersihkan 8 miligram protein EPO manusia daripada 2,550 liter air kencing daripada pesakit Jepun dengan anemia aplastik.

Pada tahun 1985, penjujukan protein dan pengklonan gen EPO manusia telah selesai. Gen EPO mengekod polipeptida dengan 193 sisa amino, yang menjadi protein matang yang terdiri daripada 166 sisa asid amino selepas peptida isyarat dipotong semasa rembesan, dan mengandungi 4 tapak untuk pengubahsuaian glikosilasi. Pada tahun 1998, struktur penyelesaian NMR EPO dan struktur kristal EPO dan kompleks reseptornya telah dianalisis. Pada ketika ini, orang ramai mempunyai pemahaman yang paling intuitif tentang EPO.

Sehingga kini, rawatan untuk anemia biasanya memerlukan pemindahan darah untuk menambah kekurangan sel darah merah. Apabila orang ramai mengetahui lebih lanjut tentang EPO, menyuntiknya untuk merangsang pengeluaran sel darah merah dalam sumsum tulang mereka sendiri telah menjadikan masalah lebih mudah. Tetapi membersihkan EPO terus daripada cecair badan, seperti yang dilakukan oleh Goldwasser, adalah sukar dan hasil yang rendah. Penentuan protein EPO dan jujukan gen memungkinkan untuk menghasilkan EPO manusia rekombinan dalam kuantiti yang banyak.

Ia dilakukan oleh syarikat bioteknologi yang dipanggil Genetik Molekul Gunaan (Amgen). Amgen telah diasaskan pada tahun 1980 dengan hanya tujuh ahli, berharap untuk membuat biofarmaseutikal dengan teknik biologi molekul yang muncul ketika itu. Interferon, faktor pelepas hormon pertumbuhan, vaksin hepatitis B, faktor pertumbuhan epidermis adalah antara nama hangat dalam senarai sasaran mereka, tetapi tiada satu pun percubaan ini berjaya. Sehingga tahun 1985, Lin Fukun, seorang saintis China dari Taiwan, China, mengklonkan gen EPO manusia, dan kemudian merealisasikan penghasilan EPO sintetik menggunakan teknologi penggabungan semula DNA.

EPO manusia rekombinan mempunyai urutan yang sama seperti protein EPO endogen, dan juga mempunyai pengubahsuaian glikosilasi yang serupa. Sememangnya, EPO manusia rekombinan juga mempunyai aktiviti EPO endogen. Pada Jun 1989, produk pertama Amgen, erythropoietin Epogen manusia rekombinan, telah diluluskan oleh FDA AS untuk rawatan anemia yang disebabkan oleh kegagalan buah pinggang kronik dan anemia dalam rawatan jangkitan HIV. Jualan Epogen mendahului $16 juta dalam masa tiga bulan sahaja. Sepanjang dua dekad akan datang, Amgen menguasai pasaran untuk EPO manusia yang dipasang semula. Epogen membawa Amgen hasil $2.5 bilion pada tahun 2010 sahaja. Pada 2018, nilai pasaran saham Amgen ialah $128.8 bilion, menjadikannya syarikat farmaseutikal kelapan terbesar di dunia.

Perlu diingat bahawa Amgen pada mulanya bekerja dengan Goldwasser untuk menyediakan protein EPO manusia yang telah dimurnikan untuk penjujukan, tetapi Goldwasser dan Amgen tidak lama lagi gagal kerana perbezaan ideologi. Goldwasser dan Universiti Chicagonya, yang melakukan penyelidikan asas, tidak pernah terfikir untuk mematenkan hormon yang ditemuinya, dan oleh itu tidak menerima satu sen pun untuk kejayaan komersial besar EPO.

Ia -- bagaimana ia perangsang

Apabila kita bernafas, oksigen memasuki mitokondria sel untuk memacu rantai pernafasan dan menghasilkan sejumlah besar ATP, sumber tenaga utama dalam badan kita. Orang anemia tidak mempunyai sel darah merah yang sihat yang mencukupi, dan kesan paling segera ialah mereka tidak mengambil oksigen yang mencukupi, yang membuatkan mereka berasa letih, sama seperti masalah pernafasan semasa jangka masa panjang. Apabila disuntik dengan EPO manusia rekombinan, badan pesakit anemia menghasilkan lebih banyak sel darah merah,membawa lebih banyak oksigen, dan menghasilkan lebih banyak molekul tenaga ATP, dengan berkesan melegakan gejala.

Walau bagaimanapun, beberapa pekerja sukan juga telah mula memikirkan EPO manusia rekombinan. Jika hormon rekombinan tiruan jenis EPO digunakan untuk merangsang badan atlet untuk menghasilkan lebih banyak sel darah merah, ia adalah mungkin untuk meningkatkan keupayaan atlet untuk mendapatkan oksigen dan menghasilkan molekul tenaga, yang juga boleh meningkatkan prestasi atlet dalam daya tahan. acara seperti berbasikal, larian jarak jauh dan ski merentas desa. Makalah 1980 dalam Journal of Applied Physiology menunjukkan bahawa perangsang darah (erythropoietin, pembawa oksigen tiruan dan pemindahan darah) boleh meningkatkan daya tahan sebanyak 34 peratus. Jika atlet menggunakan EPO, mereka boleh berlari sejauh 8 kilometer di atas treadmill dalam masa 44 saat kurang daripada sebelumnya. Malah, berbasikal dan maraton adalah pesalah yang paling teruk untuk perangsang EPO. Semasa Tour de France 1998, seorang doktor pasukan Sepanyol untuk pasukan Festina telah ditangkap di sempadan Perancis dengan 400 botol EPO rekombinan tiruan! Hasilnya, sudah tentu, keseluruhan pasukan telah ditendang keluar dari Jelajah dan diharamkan.

Jawatankuasa Olimpik Antarabangsa menambah EPO ke senarai larangannya pada Sukan Barcelona 1992, tetapi penyusunan semula ujian EPO manusia adalah sangat sukar sehingga sebelum Sukan 2000 tidak ada cara untuk mengesan dengan berkesan sama ada atlet menggunakannya. Terdapat beberapa sebab: 1) Kandungan EPO dalam cecair badan adalah sangat rendah, dan EPO per ml darah pada orang normal adalah kira-kira 130-230 nanogram; 2) Komposisi asid amino EPO rekombinan tiruan adalah sama dengan protein EPO endogen manusia, hanya bentuk glikosilasi yang berbeza sedikit; 3) Separuh hayat EPO dalam darah hanya 5-6 jam, dan ia biasanya tidak dapat dikesan 4-7 hari selepas suntikan terakhir; 4) Tahap EPO individu adalah sangat berbeza, jadi sukar untuk mewujudkan piawaian kuantitatif mutlak.

Sejak tahun 2000, WADA telah menggunakan ujian air kencing sebagai satu-satunya kaedah pengesahan saintifik untuk pengesanan langsung EPO rekombinan. Disebabkan oleh sedikit perbezaan antara bentuk terglikolasi EPO rekombinan buatan dan EPO manusia, sifat bercas bagi kedua-dua molekul adalah sangat kecil dan boleh dibezakan dengan kaedah elektroforesis yang dipanggil pemfokusan isoelektrik, yang merupakan strategi utama untuk pengesanan langsung EPO rekombinan tiruan. Walau bagaimanapun, beberapa EPO rekombinan yang dinyatakan oleh sel terbitan manusia tidak menunjukkan perbezaan dalam glikosilasi, jadi sesetengah pakar mencadangkan bahawa EPO eksogen dan EPO endogen harus dibezakan dengan kandungan isotop karbon yang berbeza.

Malah, masih terdapat batasan dalam kaedah ujian yang berbeza untuk EPO. Sebagai contoh, Lance Armstrong, legenda berbasikal Amerika, mengaku mengambil EPO dan perangsang lain semasa tujuh kemenangan Tour de France, tetapi dia sebenarnya tidak disahkan positif EPO dalam mana-mana ujian doping pada masa itu. Kita masih perlu menunggu dan melihat sama ada ia "lebih tinggi satu kaki" atau "lebih tinggi satu kaki".

Bagaimana ia membuat Hadiah Nobel

Kata terakhir tentang kaitan antara EPO dan Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Perubatan 2019.

EPO ialah kes yang paling tipikal bagi persepsi dan tindak balas badan manusia terhadap hipoksia. Oleh itu, Semenza dan Ratcliffe, dua pemenang Nobel, memilih EPO sebagai titik permulaan untuk mengkaji mekanisme persepsi sel dan penyesuaian kepada hipoksia. Langkah pertama ialah mencari unsur gen EPO yang boleh bertindak balas terhadap perubahan oksigen. Semenza mengenal pasti urutan bukan pengekodan 256 asas pada hujung hiliran gen pengekodan gen 3' EPO, dinamakan elemen tindak balas hipoksia. Jika jujukan unsur ini dimutasi atau dipadamkan, keupayaan protein EPO untuk bertindak balas terhadap hipoksia sangat berkurangan. Jika jujukan unsur ini disatukan ke hujung hiliran gen lain yang tidak dikaitkan dengan hipoksia, gen yang diubah suai ini juga menunjukkan pengaktifan seperti EPOdi bawah keadaan hipoksia.

Ratcliffe dan pasukannya kemudian mendapati bahawa unsur tindak balas hipoksik ini bukan sahaja terdapat dalam sel buah pinggang atau hati yang bertanggungjawab untuk pengeluaran EPO, tetapi juga dalam banyak jenis sel lain yang boleh berfungsi di bawah keadaan hipoksik. Dalam erti kata lain, tindak balas terhadap hipoksia ini mungkin tidak khusus untuk EPO, sebaliknya fenomena yang lebih meluas dalam sel. Sel-sel lain ini, yang tidak bertanggungjawab untuk pengeluaran EPO, mesti mengandungi molekul (seperti faktor transkripsi yang bertanggungjawab untuk menghidupkan ekspresi gen) yang merasakan perubahan dalam kepekatan oksigen dan mengikat unsur tindak balas hipoksik untuk menghidupkan gen seperti EPO.