Trzech laureatów Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny z 2019 r., William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza i Sir Peter J. Ratcliffe, zdobyli już Nagrodę Laskera w dziedzinie medycyny podstawowej w 2016 r. za pracę nad sposobem, w jaki komórki wyczuwają i adaptują się do niedotlenienia, więc nie było to szczególnie zaskakujące. Odkryli i zidentyfikowali kluczową cząsteczkę czynnika indukowanego niedotlenieniem 1 (HIF-1). Dzisiaj chcemy wrócić do źródła badania, którym jest erytropoetyna, czyli EPO, cudowna cząsteczka.

Jest to najważniejszy czynnik w produkcji czerwonych krwinek

Krwinki czerwone są najbardziej rozpowszechnionym rodzajem krwinek we krwi i są głównym środkiem transportu tlenu i dwutlenku węgla przez krew kręgowców. Erytrocyty są generowane w szpiku kostnym: hematopoetyczne komórki macierzyste najpierw namnażają się i różnicują w progenitory różnych komórek krwi, a prekursory erytrocytów mogą dalej różnicować się i dojrzewać do erytrocytów. W normalnych warunkach tempo produkcji erytrocytów u ludzi jest bardzo niskie, ale pod wpływem stresu, takiego jak krwawienie, hemoliza i niedotlenienie, tempo produkcji erytrocytów może wzrosnąć nawet ośmiokrotnie. W tym procesie erytropoetyna EPO jest jednym z najważniejszych czynników.

EPO to hormon syntetyzowany głównie w nerkach. Jego natura chemiczna jest wysoce glikozylowanym białkiem. Dlaczego w nerkach? Około litra krwi przepływa przez nerki co minutę, dzięki czemu mogą one szybko i skutecznie wykrywać zmiany poziomu tlenu we krwi. Kiedy poziom tlenu we krwi jest niski, nerki reagują szybko i wytwarzają duże ilości EPO. Ta ostatnia krąży w krwioobiegu do szpiku kostnego, gdzie sprzyja przemianie komórek progenitorowych erytroidów w krwinki czerwone. Dojrzałe krwinki czerwone są uwalniane ze szpiku kostnego do układu krążenia, aby poprawić zdolność organizmu do wiązania tlenu. Kiedy nerki wyczuwają wzrost poziomu tlenu we krwi, zmniejszają produkcję EPO, co z kolei zmniejsza ilość czerwonych krwinek w szpiku kostnym.

Tworzy to idealną pętlę regulacji. Jednak ludzie żyjący na dużych wysokościach i niektórzy pacjenci z niedokrwistością często napotykają stan stale niskiego poziomu tlenu we krwi, który nie może ukończyć powyższego krążenia i stymulować nerki do ciągłego wydzielania EPO, tak że stężenie EPO we krwi jest wyższe niż u zwykłych ludzi.

Odkrycie go zajęło prawie 80 lat

Podobnie jak w przypadku wielu ważnych odkryć, zrozumienie EPO przez naukowców nie przebiegało gładko, z pytaniami i wyzwaniami po drodze. Od koncepcji EPO do ostatecznego określenia konkretnej cząsteczki minęło prawie 80 lat.

W 1906 roku francuscy naukowcy Carnot i Deflandre wstrzyknęli normalnym królikom surowicę anemicznych królików i odkryli, że liczba czerwonych krwinek w osoczu normalnych królików wzrosła. Uważali, że niektóre czynniki humoralne w osoczu mogą stymulować i regulować produkcję czerwonych krwinek. Był to pierwszy prototyp koncepcyjny EPO. Niestety, wyniki nie zostały powtórzone w kolejnych dziesięcioleciach, głównie dlatego, że liczba nowych krwinek czerwonych nie była dokładna.

Eksperyment parabiozy Reissmanna i Ruhenstrotha-Bauera w 1950 roku dostarczył naprawdę mocnych dowodów. Chirurgicznie połączyli układy krążenia dwóch żywych szczurów, umieszczając jednego w niedotlenionym środowisku, a drugiego oddychając normalnym powietrzem. W rezultacie obie myszy wytwarzały ogromne ilości czerwonych krwinek. Nie ma wątpliwości, że w krwioobiegu znajduje się hormon stymulujący produkcję czerwonych krwinek, od którego wzięła się nazwa EPO. Z drugiej strony EPO jest bardzo wrażliwa na niedotlenienie.

Jaką cząsteczką jest EPO? Ostateczne wyjaśnienie problemu na poziomie biochemicznym zajęło amerykańskiemu naukowcowi Goldwasserowi 30 lat. Jeśli robotnik chce dobrze wykonywać swoją pracę, musi najpierw naostrzyć swoje narzędzia. Funkcją EPO jest stymulowanie nowych czerwonych krwinek, aleliczba tych ostatnich nie jest dokładna. Najważniejszą funkcjonalną cząsteczką w czerwonych krwinkach jest hem zawierający hemoglobinę, która zawiera jon żelazawy w swoim centrum. Tak więc zespół Goldwassera oznaczył nowonarodzone krwinki czerwone radioaktywnymi izotopami żelaza i opracował czułą metodę wykrywania aktywności EPO. Umożliwia to izolowanie i oczyszczanie bardzo niskich stężeń EPO (nanogramów na mililitr) z próbek płynów zwierzęcych. Jednak izolacja EPO była niezwykle trudna. Przestawili się z nerki na anemiczne owcze osocze, na mocz pacjentów z ciężkim niedoborem żelaza spowodowanym infekcją tęgoryjcem, aw końcu w 1977 roku oczyścili 8 miligramów ludzkiego białka EPO z 2550 litrów moczu japońskich pacjentów z anemią aplastyczną.

W 1985 r. zakończono sekwencjonowanie białek i klonowanie genów ludzkiej EPO. Gen EPO koduje polipeptyd o 193 resztach aminowych, który staje się dojrzałym białkiem złożonym ze 166 reszt aminokwasowych po odcięciu peptydu sygnałowego podczas wydzielania i zawiera 4 miejsca modyfikacji glikozylacji. W 1998 roku przeanalizowano strukturę roztworu NMR EPO oraz strukturę krystaliczną EPO i jej kompleksu receptorowego. W tym momencie ludzie mają najbardziej intuicyjne zrozumienie EPO.

Do tej pory leczenie anemii wymagało zwykle transfuzji krwi w celu uzupełnienia niedoboru krwinek czerwonych. Ponieważ ludzie dowiadują się więcej o EPO, wstrzykiwanie jej w celu stymulacji produkcji czerwonych krwinek we własnym szpiku kostnym ułatwiło problem. Jednak oczyszczanie EPO bezpośrednio z płynów ustrojowych, tak jak zrobił to Goldwasser, jest trudne, a wydajność jest niska. Określenie białka EPO i sekwencji genów umożliwiło produkcję rekombinowanej ludzkiej EPO w dużych ilościach.

Dokonała tego firma biotechnologiczna o nazwie Applied Molecular Genetics (Amgen). Firma Amgen została założona w 1980 roku z zaledwie siedmioma członkami, mając nadzieję na wytwarzanie biofarmaceutyków za pomocą pojawiających się wówczas technik biologii molekularnej. Interferon, czynnik uwalniający hormon wzrostu, szczepionka przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, naskórkowy czynnik wzrostu były jednymi z gorących nazwisk na ich liście celów, ale żadna z tych prób nie powiodła się. Do 1985 roku Lin Fukun, chiński naukowiec z Tajwanu sklonował gen ludzkiej EPO, a następnie zrealizował produkcję syntetycznej EPO przy użyciu technologii rekombinacji DNA.

Rekombinowana ludzka EPO ma taką samą sekwencję jak endogenne białko EPO, a także ma podobną modyfikację glikozylacji. Naturalnie rekombinowana ludzka EPO ma również aktywność endogennej EPO. W czerwcu 1989 r. amerykańska FDA zatwierdziła pierwszy produkt firmy Amgen, rekombinowaną ludzką erytropoetynę Epogen, do leczenia niedokrwistości spowodowanej przewlekłą niewydolnością nerek oraz niedokrwistości w leczeniu zakażenia wirusem HIV. Sprzedaż Epogen przekroczyła 16 milionów dolarów w ciągu zaledwie trzech miesięcy. W ciągu następnych dwóch dekad firma Amgen zdominowała rynek ponownie złożonej ludzkiej EPO. Tylko w 2010 roku firma Epogen przyniosła firmie Amgen 2,5 miliarda dolarów przychodów. W 2018 roku wartość giełdowa Amgen wyniosła 128,8 miliardów dolarów, co czyni ją ósmą co do wielkości firmą farmaceutyczną na świecie.

Warto zauważyć, że Amgen początkowo współpracował z Goldwasserem w celu dostarczenia oczyszczonych ludzkich białek EPO do sekwencjonowania, ale Goldwasser i Amgen wkrótce pokłócili się z powodu różnic ideologicznych. Goldwasser i jego University of Chicago, który prowadził podstawowe badania, nigdy nie pomyśleli o opatentowaniu odkrytego przez siebie hormonu, więc nie otrzymali ani grosza za ogromny sukces komercyjny EPO.

To -- jak to jest środek pobudzający

Kiedy oddychamy, tlen dostaje się do mitochondriów komórek, aby napędzać łańcuch oddechowy i wytwarzać ogromne ilości ATP, głównego źródła energii w naszych ciałach. Ludzie z anemią nie mają wystarczającej ilości zdrowych czerwonych krwinek, a najbardziej natychmiastowym skutkiem jest to, że nie przyjmują wystarczającej ilości tlenu, co powoduje, że czują się zmęczeni, podobnie jak problemy z oddychaniem podczas długiego biegu. Po wstrzyknięciu rekombinowanej ludzkiej EPO ciała pacjentów z niedokrwistością wytwarzają więcej czerwonych krwinek,przenoszą więcej tlenu i wytwarzają więcej cząsteczki energii ATP, skutecznie łagodząc objawy.

Jednak niektórzy pracownicy sportowi również zaczęli myśleć o rekombinowanej ludzkiej EPO. Zastosowanie sztucznego rekombinowanego hormonu typu EPO do stymulacji organizmu sportowca do produkcji większej ilości krwinek czerwonych umożliwia poprawę zdolności sportowców do pozyskiwania tlenu i produkcji cząsteczek energii, co może również poprawić wyniki sportowców wytrzymałościowych takich jak kolarstwo, biegi długodystansowe i narciarstwo biegowe. Artykuł z 1980 roku w Journal of Applied Physiology wykazał, że stymulanty krwi (erytropoetyna, sztuczne nośniki tlenu i transfuzje krwi) mogą zwiększyć wytrzymałość o 34 procent. Jeśli sportowcy stosują EPO, mogą przebiec 8 kilometrów na bieżni w 44 sekundy krócej niż wcześniej. W rzeczywistości jazda na rowerze i maratony były najgorszymi przestępcami dla stymulantów EPO. Podczas Tour de France w 1998 roku hiszpański lekarz zespołu Festina został aresztowany na francuskiej granicy z 400 butelkami sztucznej rekombinowanej EPO! Rezultatem było oczywiście to, że cały zespół został wyrzucony z trasy i zbanowany.

Międzynarodowy Komitet Olimpijski dodał EPO do swojej listy zakazanych substancji na Igrzyskach w Barcelonie w 1992 roku, ale reorganizacja testów EPO na ludziach była tak trudna, że ​​przed Igrzyskami w 2000 roku nie było możliwości skutecznego wykrycia, czy sportowcy jej używają. Jest kilka powodów: 1) zawartość EPO w płynach ustrojowych jest bardzo niska, a EPO na ml krwi u zdrowych ludzi wynosi około 130-230 nanogramów; 2) Skład aminokwasowy sztucznej rekombinowanej EPO jest dokładnie taki sam jak ludzkiego endogennego białka EPO, tylko forma glikozylacji jest bardzo nieznacznie inna; 3) Okres półtrwania EPO we krwi wynosi tylko 5-6 godzin i jest na ogół niewykrywalny 4-7 dni po ostatnim wstrzyknięciu; 4) Indywidualny poziom EPO jest bardzo różny, dlatego trudno jest ustalić bezwzględny standard ilościowy.

Od 2000 roku WADA stosuje badanie moczu jako jedyną naukową metodę weryfikacji bezpośredniego wykrywania rekombinowanej EPO. Ze względu na niewielkie różnice między glikoilowaną postacią sztucznej rekombinowanej EPO i ludzką EPO, właściwości naładowane obu cząsteczek są bardzo małe i można je rozróżnić metodą elektroforezy zwaną ogniskowaniem izoelektrycznym, która jest główną strategią bezpośrednie wykrywanie sztucznej rekombinowanej EPO. Jednak niektóre rekombinowane EPO wyrażane przez komórki pochodzenia ludzkiego nie wykazywały różnic w glikozylacji, więc niektórzy eksperci sugerowali, że egzogenna EPO i endogenna EPO powinny być rozróżniane na podstawie różnej zawartości izotopów węgla.

W rzeczywistości nadal istnieją ograniczenia w różnych metodach testowania EPO. Na przykład Lance Armstrong, legenda amerykańskiego kolarstwa, przyznał się do przyjmowania EPO i innych stymulantów podczas swoich siedmiu zwycięstw w Tour de France, ale w żadnym teście antydopingowym nie potwierdzono u niego pozytywnego wyniku EPO. Musimy jeszcze poczekać i zobaczyć, czy jest „o jedną stopę wyżej”, czy „o jedną stopę wyżej”.

Jak to się robi Nagroda Nobla

Ostatnie słowo na temat związku między EPO a Nagrodą Nobla 2019 w dziedzinie fizjologii lub medycyny.

EPO jest najbardziej typowym przypadkiem percepcji i reakcji ludzkiego organizmu na niedotlenienie. Dlatego Semenza i Ratcliffe, dwaj laureaci Nagrody Nobla, wybrali EPO jako punkt wyjścia do badania mechanizmu percepcji komórek i adaptacji do niedotlenienia. Pierwszym krokiem było znalezienie elementów genu EPO, które mogłyby reagować na zmiany tlenu. Semenza zidentyfikował kluczową niekodującą sekwencję o 256 zasadach na końcu 3' genu kodującego EPO, nazwaną elementem odpowiedzi na hipoksję. Jeśli ta sekwencja elementów zostanie zmutowana lub usunięta, zdolność białka EPO do reagowania na niedotlenienie jest znacznie zmniejszona. Jeśli sekwencja tego elementu zostanie poddana fuzji z końcem 3' w dół innych genów niezwiązanych z niedotlenieniem, te zmodyfikowane geny również wykazują aktywację podobną do EPOw warunkach hipoksji.

Ratcliffe i jego zespół odkryli następnie, że ten element odpowiedzi na niedotlenienie jest obecny nie tylko w komórkach nerki lub wątroby odpowiedzialnych za produkcję EPO, ale także w wielu innych typach komórek, które mogą funkcjonować w warunkach niedotlenienia. Innymi słowy, ta reakcja na niedotlenienie może nie być specyficzna dla EPO, ale raczej bardziej rozpowszechnionym zjawiskiem w komórkach. Te inne komórki, które nie są odpowiedzialne za wytwarzanie EPO, muszą zawierać cząsteczki (takie jak czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za włączenie ekspresji genów), które wyczuwają zmiany stężenia tlenu i wiążą się z elementami odpowiedzi na niedotlenienie, aby włączyć geny, takie jak EPO.