Cei trei câștigători ai Premiului Nobel pentru Fiziologie sau Medicină în 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza și Sir Peter J. Ratcliffe, câștigaseră deja Premiul Lasker în Medicină de bază în 2016 pentru munca lor privind modul în care celulele simt și se adaptează. la hipoxie, așa că nu a fost deosebit de surprinzător. Ei au descoperit și identificat molecula cheie factorul 1 inductibil de hipoxie (HIF-1). Astăzi vrem să ne întoarcem la originea studiului, care este eritropoietina sau EPO, o moleculă miracolă.

Este cel mai important factor în producția de globule roșii

Celulele roșii sunt cel mai abundent tip de celule sanguine din sânge și sunt principalul mediu pentru transportul oxigenului și dioxidului de carbon prin sângele vertebratelor. Eritrocitele sunt generate în măduva osoasă: celulele stem hematopoietice mai întâi proliferează și se diferențiază în progenitori ai diferitelor celule sanguine, iar progenitorii eritroizi se pot diferenția și se maturizează în continuare în eritrocite. În condiții normale, rata producției de eritrocite umane este foarte scăzută, dar în condiții de stres, cum ar fi sângerare, hemoliză și hipoxie, rata producției de eritrocite poate fi crescută de până la opt ori. În acest proces, eritropoietina EPO este unul dintre cei mai importanți factori.

EPO este un hormon sintetizat în principal în rinichi. Natura sa chimică este o proteină foarte glicozilată. De ce în rinichi? Aproximativ un litru de sânge curge prin rinichi în fiecare minut, astfel încât aceștia pot detecta rapid și eficient modificările nivelului de oxigen din sânge. Când nivelul de oxigen din sânge este scăzut, rinichii răspund rapid și produc cantități mari de EPO. Acesta din urmă circulă prin fluxul sanguin până în măduva osoasă, unde favorizează conversia celulelor progenitoare eritroide în globule roșii. Celulele roșii mature sunt eliberate din măduva osoasă în sistemul circulator pentru a îmbunătăți capacitatea organismului de a se lega de oxigen. Când rinichii simt o creștere a oxigenului în sânge, ei reduc producția de EPO, care, la rândul său, reduce cantitatea de globule roșii din măduva osoasă.

Acest lucru face o buclă de ajustare perfectă. Cu toate acestea, persoanele care trăiesc la mare altitudine și unii pacienți cu anemie se confruntă adesea cu starea unui nivel de oxigen continuu scăzut în sânge, care nu poate finaliza circulația de mai sus și nu poate stimula rinichiul să secrete continuu EPO, astfel încât concentrația de EPO în sânge este mai mare decât oamenii obișnuiți.

A fost nevoie de aproape 80 de ani pentru a-l descoperi

La fel ca multe descoperiri majore, înțelegerea de către oamenii de știință a EPO nu s-a desfășurat fără probleme, cu întrebări și provocări pe parcurs. Au durat aproape 80 de ani de la conceptul de EPO până la determinarea finală a moleculei specifice.

În 1906, oamenii de știință francezi Carnot și Deflandre au injectat iepuri normali cu ser de iepuri anemici și au descoperit că numărul de globule roșii din plasma iepurilor normali a crescut. Ei credeau că unii factori umorali din plasmă ar putea stimula și regla producția de globule roșii. Acesta a fost primul prototip de concept EPO. Din păcate, rezultatele nu au fost replicate în deceniile următoare, în principal pentru că numărul de noi celule roșii din sânge nu a fost precis.

Experimentul de parabioză al lui Reissmann și Ruhenstroth-Bauer din 1950 a oferit dovezi cu adevărat puternice. Aceștia au legat chirurgical sistemele circulatorii a doi șobolani vii, plasându-l pe unul într-un mediu hipoxic, iar celălalt respirând aer normal. Ca rezultat, ambii șoareci au produs cantități masive de globule roșii. Nu există nicio îndoială că există un hormon în fluxul sanguin care stimulează producția de globule roșii, de la care EPO își ia numele. Pe de altă parte, EPO este foarte sensibil la hipoxie.

Ce moleculă este EPO? I-au trebuit omului de știință american Goldwasser 30 de ani pentru a clarifica în sfârșit problema la nivel biochimic. Dacă un muncitor vrea să facă o treabă bună, trebuie mai întâi să-și ascute uneltele. Funcția EPO este de a stimula noi celule roșii din sânge, darnumărul acestora din urmă nu este exact. Cea mai importantă moleculă funcțională din celulele roșii din sânge este hemul care conține hemoglobină, care conține un ion feros în centrul său. Deci, echipa lui Goldwasser a etichetat celulele roșii din sângele nou-născuților cu izotopi de fier radioactiv și a dezvoltat o metodă sensibilă pentru detectarea activității EPO. Acest lucru face posibilă izolarea și purificarea concentrațiilor foarte scăzute de EPO (nanograme per mililitru) din probele de fluide animale. Dar izolarea EPO a fost extrem de dificilă. Au trecut de la rinichi la plasma anemică de oaie, la urina pacienților cu deficit sever de fier din cauza infecției cu anchilostoma și, în cele din urmă, în 1977, au purificat 8 miligrame de proteină EPO umană din 2.550 de litri de urină de la pacienții japonezi cu anemie aplastică.

În 1985, secvențierea proteinelor și donarea genelor EPO umană au fost finalizate. Gena EPO codifică o polipeptidă cu 193 de resturi amino, care devine o proteină matură compusă din 166 de resturi de aminoacizi după ce peptida semnal este tăiată în timpul secreției și conține 4 situsuri pentru modificarea glicozilării. În 1998, structura soluției RMN a EPO și structura cristalină a EPO și complexul său receptor au fost analizate. În acest moment, oamenii au cea mai intuitivă înțelegere a EPO.

Până acum, tratamentul anemiei necesita de obicei transfuzii de sânge pentru a umple deficitul de globule roșii. Pe măsură ce oamenii învață mai multe despre EPO, injectarea acesteia pentru a stimula producția de globule roșii din propria lor măduvă osoasă a ușurat problema. Dar purificarea EPO direct din fluidele corporale, așa cum a făcut Goldwasser, este dificilă și randamentele sunt scăzute. Determinarea proteinei EPO și a secvenței genei a făcut posibilă producerea de EPO umană recombinată în cantități mari.

A fost realizat de o companie de biotehnologie numită Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen a fost înființată în 1980 cu doar șapte membri, în speranța de a produce produse biofarmaceutice cu tehnicile de biologie moleculară apărute atunci. Interferonul, factorul de eliberare a hormonului de creștere, vaccinul împotriva hepatitei B, factorul de creștere epidermică s-au numărat printre numele fierbinți de pe lista lor de ținte, dar niciuna dintre aceste încercări nu a reușit. Până în 1985, Lin Fukun, un om de știință chinez din Taiwan, China, a clonat gena EPO umană și apoi a realizat producerea de EPO sintetic folosind tehnologia de recombinare a ADN-ului.

EPO umană recombinantă are aceeași secvență ca și proteina EPO endogenă și, de asemenea, are o modificare similară de glicozilare. În mod natural, EPO umană recombinată are, de asemenea, activitatea EPO endogenă. În iunie 1989, primul produs Amgen, eritropoietina umană recombinată Epogen, a fost aprobat de FDA din SUA pentru tratamentul anemiei cauzate de insuficiență renală cronică și anemie în tratamentul infecției cu HIV. Vânzările Epogen au depășit 16 milioane de dolari în doar trei luni. În următoarele două decenii, Amgen a dominat piața EPO umană reasamblată. Epogen a adus Amgen venituri de 2,5 miliarde de dolari doar în 2010. În 2018, valoarea bursieră a Amgen a fost de 128,8 miliarde de dolari, fiind a opta cea mai mare companie farmaceutică din lume.

Este demn de remarcat faptul că Amgen a lucrat inițial cu Goldwasser pentru a furniza proteine ​​EPO umane purificate pentru secvențiere, dar Goldwasser și Amgen au căzut curând din cauza diferențelor ideologice. Goldwasser și Universitatea sa din Chicago, care au făcut cercetări de bază, nu s-au gândit niciodată să breveteze hormonul descoperit de el și, prin urmare, nu au primit niciun ban pentru succesul comercial uriaș al EPO.

Este -- cum este un stimulent

Când respirăm, oxigenul intră în mitocondriile celulelor pentru a conduce lanțul respirator și pentru a produce cantități masive de ATP, principala sursă de energie din corpul nostru. Persoanele anemice nu au suficiente globule roșii sănătoase, iar efectul cel mai imediat este că nu iau suficient oxigen, ceea ce îi face să se simtă obosiți, asemănător cu problemele de respirație pe termen lung. Când este injectat cu EPO uman recombinant, corpurile pacienților cu anemie produc mai multe globule roșii,transportă mai mult oxigen și produc mai multă molecula de energie ATP, ameliorând eficient simptomele.

Cu toate acestea, unii lucrători din sport au început să se gândească și la EPO uman recombinant. Dacă hormonul artificial recombinant de tip EPO este folosit pentru a stimula organismul atleților să producă mai multe globule roșii, este posibilă îmbunătățirea capacității sportivilor de a obține oxigen și de a produce molecule de energie, ceea ce poate îmbunătăți și performanța sportivilor în anduranță. evenimente precum ciclism, alergare pe distanțe lungi și schi fond. O lucrare din 1980 din Journal of Applied Physiology a arătat că stimulentele sanguine (eritropoietina, purtători artificiali de oxigen și transfuzii de sânge) pot crește rezistența cu 34 la sută. Dacă sportivii folosesc EPO, pot alerga 8 kilometri pe banda de alergare în 44 de secunde mai puțin decât înainte. De fapt, ciclismul și maratoanele au fost cei mai grav delincvenți pentru stimulentele EPO. În timpul Turului Franței din 1998, un medic de echipă spaniolă pentru echipa Festina a fost arestat la granița cu Franța cu 400 de sticle de EPO recombinat artificial! Rezultatul, desigur, a fost că întreaga echipă a fost dată afară din Tur și interzisă.

Comitetul Olimpic Internațional a adăugat EPO pe lista sa interzisă la Jocurile de la Barcelona din 1992, dar reorganizarea testării EPO umane a fost atât de dificilă încât înainte de Jocurile din 2000 nu exista nicio modalitate de a detecta în mod eficient dacă sportivii îl foloseau. Există mai multe motive: 1) conținutul de EPO în fluidele corporale este foarte scăzut, iar EPO per ml de sânge la oamenii normali este de aproximativ 130-230 nanograme; 2) Compoziția de aminoacizi a EPO recombinată artificială este exact aceeași cu cea a proteinei EPO endogene umane, doar forma de glicozilare este foarte ușor diferită; 3) Timpul de înjumătățire al EPO în sânge este de numai 5-6 ore și, în general, este nedetectabil la 4-7 zile de la ultima injecție; 4) Nivelul individual de EPO este foarte diferit, deci este dificil să se stabilească un standard cantitativ absolut.

Din 2000, WADA a folosit testarea urinei ca singura metodă de verificare științifică pentru detectarea directă a EPO recombinant. Datorită diferențelor ușoare dintre forma glicoilată a EPO recombinată artificială și cea a EPO umană, proprietățile încărcate ale celor două molecule sunt foarte mici și pot fi distinse printr-o metodă de electroforeză numită focalizare izoelectrică, care este strategia principală pentru detectarea directă a EPO recombinant artificial. Cu toate acestea, unele EPO recombinate exprimate de celulele derivate umane nu au arătat nicio diferență în glicozilare, așa că unii experți au sugerat că EPO exogen și EPO endogen ar trebui să se distingă prin conținut diferit de izotopi de carbon.

De fapt, există încă limitări în diferitele metode de testare pentru EPO. De exemplu, Lance Armstrong, legenda americană a ciclismului, a recunoscut că a luat EPO și alți stimulenți în timpul celor șapte victorii ale sale în Turul Franței, dar nu a fost de fapt confirmat pozitiv pentru EPO la niciun test antidoping la acel moment. Mai trebuie să așteptăm și să vedem dacă este „un picior mai sus” sau „un picior mai sus”.

Cum se face un premiu Nobel

Un ultim cuvânt despre legătura dintre EPO și Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină 2019.

EPO este cel mai tipic caz de percepție și răspuns al corpului uman la hipoxie. Prin urmare, Semenza și Ratcliffe, doi laureați ai Premiului Nobel, au ales EPO ca punct de plecare pentru a studia mecanismul percepției celulare și al adaptării la hipoxie. Primul pas a fost găsirea elementelor genei EPO care ar putea răspunde la schimbările de oxigen. Semenza a identificat o secvență cheie necodificatoare de 256 de baze la capătul 3' din aval al genei care codifică EPO, numită elementul de răspuns la hipoxie. Dacă această secvență de elemente este mutată sau ștearsă, capacitatea proteinei EPO de a răspunde la hipoxie este mult redusă. Dacă această secvență de elemente este fuzionată la capătul 3' din aval al altor gene care nu sunt asociate cu hipoxie, aceste gene modificate prezintă, de asemenea, activare asemănătoare EPO.în condiții de hipoxie.

Ratcliffe și echipa sa au descoperit apoi că acest element de răspuns hipoxic nu este prezent doar în celulele renale sau hepatice responsabile de producerea EPO, ci și în multe alte tipuri de celule care pot funcționa în condiții hipoxice. Cu alte cuvinte, acest răspuns la hipoxie poate să nu fie specific EPO, ci mai degrabă un fenomen mai răspândit în celule. Aceste alte celule, care nu sunt responsabile pentru producția de EPO, trebuie să conțină molecule (cum ar fi factorii de transcripție responsabili pentru activarea expresiei genelor) care simt modificările concentrației de oxigen și se leagă de elementele de răspuns hipoxic pentru a activa gene precum EPO.