Три лауреата Нобелевской премии по физиологии и медицине 2019 года, Уильям Г. Келин-младший, Грегг Л. Семенца и сэр Питер Дж. Рэтклифф, уже получили премию Ласкера 2016 года в области фундаментальной медицины за свою работу о том, как клетки чувствуют и адаптируются. к гипоксии, так что это не было особенно удивительно. Они обнаружили и идентифицировали ключевую молекулу, индуцируемую гипоксией, фактор 1 (HIF-1). Сегодня мы хотим вернуться к истокам исследования, к эритропоэтину, или ЭПО, чудодейственной молекуле.
Это самый важный фактор в производстве эритроцитов.
Эритроциты являются наиболее распространенным типом клеток крови в крови и являются основной средой для транспорта кислорода и углекислого газа через кровь позвоночных. Эритроциты образуются в костном мозге: гемопоэтические стволовые клетки сначала пролиферируют и дифференцируются в предшественники различных клеток крови, а эритроидные предшественники могут в дальнейшем дифференцироваться и созревать в эритроциты. В нормальных условиях скорость продукции эритроцитов у человека очень низкая, но при стрессах, таких как кровотечение, гемолиз и гипоксия, скорость продукции эритроцитов может увеличиваться до восьми раз. В этом процессе эритропоэтин ЭПО является одним из наиболее важных факторов.
ЭПО представляет собой гормон, синтезируемый в основном в почках. Его химическая природа представляет собой сильно гликозилированный белок. Почему в почках? Каждую минуту через почки проходит около литра крови, поэтому они могут быстро и эффективно обнаруживать изменения уровня кислорода в крови. Когда уровень кислорода в крови низкий, почки быстро реагируют и производят большое количество ЭПО. Последний циркулирует по кровотоку в костный мозг, где способствует превращению эритроидных клеток-предшественников в эритроциты. Зрелые эритроциты выделяются из костного мозга в кровеносную систему, чтобы улучшить способность организма связывать кислород. Когда почки ощущают увеличение содержания кислорода в крови, они снижают выработку ЭПО, что, в свою очередь, снижает количество эритроцитов в костном мозге.
Получается идеальная регулировочная петля. Однако люди, живущие на большой высоте, и некоторые больные анемией часто сталкиваются с состоянием постоянного низкого уровня кислорода в крови, что не может завершить вышеуказанную циркуляцию и стимулировать почки к постоянной секреции ЭПО, так что концентрация ЭПО в крови выше, чем у обычных людей.
На его открытие ушло почти 80 лет.
Как и многие крупные открытия, понимание ЭПО учеными не было гладким, с вопросами и проблемами на этом пути. От концепции ЭПО до окончательного определения конкретной молекулы прошло почти 80 лет.
В 1906 году французские ученые Карно и Дефланд вводили нормальным кроликам сыворотку анемичных кроликов и обнаружили, что количество эритроцитов в плазме нормальных кроликов увеличилось. Они считали, что некоторые гуморальные факторы в плазме могут стимулировать и регулировать выработку эритроцитов. Это был первый концептуальный прототип EPO. К сожалению, результаты не были воспроизведены в последующие десятилетия, главным образом потому, что подсчет новых эритроцитов был неточным.
Эксперимент Рейссманна и Рухенстрот-Бауэра с парабиозом в 1950 году предоставил действительно убедительные доказательства. Они хирургическим путем соединили кровеносные системы двух живых крыс, поместив одну в гипоксию, а другую дыша нормальным воздухом. В результате у обеих мышей вырабатывалось огромное количество эритроцитов. Нет сомнений в том, что в кровотоке есть гормон, стимулирующий выработку эритроцитов, от которого ЭПО получил свое название. С другой стороны, ЭПО очень чувствителен к гипоксии.
Какая молекула представляет собой ЭПО? 30 лет потребовалось американскому ученому Гольдвассеру, чтобы окончательно прояснить проблему на биохимическом уровне. Если рабочий хочет хорошо работать, он должен сначала заточить свои инструменты. Функция ЭПО заключается в стимуляции новых эритроцитов, ноподсчет последних неточен. Наиболее важной функциональной молекулой эритроцитов является гемоглобин, содержащий гем, который содержит ион двухвалентного железа в своем центре. Поэтому группа Гольдвассера пометила эритроциты новорожденных радиоактивными изотопами железа и разработала чувствительный метод определения активности ЭПО. Это позволяет выделять и очищать очень низкие концентрации ЭПО (нанограммы на миллилитр) из образцов жидкостей животных. Но выделение ЭПО было чрезвычайно сложным. Они перешли от почечной к анемичной овечьей плазме, к моче пациентов с тяжелым дефицитом железа из-за заражения анкилостомами и, наконец, в 1977 г. очистили 8 миллиграммов белка ЭПО человека из 2550 литров мочи японских пациентов с апластической анемией.
В 1985 г. было завершено секвенирование белка и клонирование гена ЭПО человека. Ген ЭПО кодирует полипептид со 193 аминокислотными остатками, который становится зрелым белком, состоящим из 166 аминокислотных остатков после клиппирования сигнального пептида во время секреции, и содержит 4 сайта для модификации гликозилирования. В 1998 г. были проанализированы структура раствора ЭПО методом ЯМР и кристаллическая структура ЭПО и его рецепторного комплекса. На данный момент люди наиболее интуитивно понимают ЭПО.
До сих пор лечение анемии обычно требовало переливания крови для восполнения дефицита эритроцитов. По мере того, как люди узнают больше об ЭПО, его инъекции для стимуляции выработки эритроцитов в собственном костном мозге облегчают проблему. Но очищать ЭПО непосредственно из жидкостей организма, как это делал Гольдвассер, сложно, а выходы низки. Определение белка ЭПО и последовательности генов позволило получить рекомбинантный ЭПО человека в больших количествах.
Это было сделано биотехнологической компанией Applied Molecular Genetics (Amgen). Компания Amgen была основана в 1980 году всего семью членами в надежде производить биофармацевтические препараты с помощью новейших методов молекулярной биологии. Интерферон, рилизинг-фактор гормона роста, вакцина против гепатита В, эпидермальный фактор роста были среди горячих названий в их списке целей, но ни одна из этих попыток не увенчалась успехом. До 1985 года Линь Фукунь, китайский ученый из Тайваня, Китай, клонировал ген ЭПО человека, а затем осуществил производство синтетического ЭПО с использованием технологии рекомбинации ДНК.
Рекомбинантный ЭПО человека имеет ту же последовательность, что и эндогенный белок ЭПО, а также имеет аналогичную модификацию гликозилирования. Естественно, рекомбинантный ЭПО человека также обладает активностью эндогенного ЭПО. В июне 1989 года первый продукт Amgen, рекомбинантный человеческий эритропоэтин Epogen, был одобрен FDA США для лечения анемии, вызванной хронической почечной недостаточностью, и анемии при лечении ВИЧ-инфекции. Продажи Epogen превысили 16 миллионов долларов всего за три месяца. В течение следующих двух десятилетий Amgen доминировала на рынке реассемблированного EPO человека. Только в 2010 году Epogen принесла Amgen 2,5 миллиарда долларов дохода. В 2018 году рыночная стоимость Amgen составила 128,8 миллиарда долларов, что сделало ее восьмой по величине фармацевтической компанией в мире.
Стоит отметить, что Amgen первоначально работала с Goldwasser, чтобы предоставить очищенные белки EPO человека для секвенирования, но Goldwasser и Amgen вскоре разошлись из-за идеологических разногласий. Голдвассер и его Чикагский университет, проводивший фундаментальные исследования, никогда не думали о патентовании открытого им гормона и поэтому не получили ни цента за огромный коммерческий успех ЭПО.
Это -- как это стимулятор
Когда мы дышим, кислород поступает в митохондрии клеток, приводя в действие дыхательную цепь и производя огромное количество АТФ, основного источника энергии в нашем организме. У людей с анемией недостаточно здоровых эритроцитов, и самым немедленным эффектом является то, что они не получают достаточного количества кислорода, что вызывает у них чувство усталости, похожее на проблемы с дыханием во время длительного бега. При введении рекомбинантного ЭПО человека в организме больных анемией вырабатывается больше эритроцитов,нести больше кислорода и производить больше молекулы энергии АТФ, эффективно облегчая симптомы.
Однако некоторые спортивные работники также начали думать о рекомбинантном ЭПО человека. Если искусственный рекомбинантный гормон типа ЭПО используется для стимуляции организма спортсменов к выработке большего количества эритроцитов, можно улучшить способность спортсменов получать кислород и производить молекулы энергии, что также может улучшить результаты спортсменов в выносливости. таких как езда на велосипеде, бег на длинные дистанции и лыжные гонки. Статья 1980 года в Журнале прикладной физиологии показала, что стимуляторы крови (эритропоэтин, искусственные переносчики кислорода и переливание крови) могут увеличить выносливость на 34 процента. Если спортсмены используют ЭПО, они могут пробежать 8 километров на беговой дорожке за 44 секунды меньше времени, чем раньше. Фактически, велоспорт и марафоны были худшими нарушителями для стимуляторов ЭПО. Во время Тур де Франс 1998 года врач испанской команды Festina был арестован на французской границе с 400 флаконами искусственного рекомбинантного ЭПО! Результатом, разумеется, стало то, что всю команду выгнали с Тура и забанили.
Международный олимпийский комитет добавил ЭПО в свой список запрещенных препаратов на Играх в Барселоне в 1992 году, но реорганизация тестирования ЭПО на людях была настолько сложной, что до Игр 2000 года не было способа эффективно определить, используют ли его спортсмены. Причин тому несколько: 1) содержание ЭПО в жидкостях организма очень низкое, а ЭПО в мл крови у нормальных людей составляет около 130-230 нанограммов; 2) Аминокислотный состав искусственного рекомбинантного ЭПО точно такой же, как у эндогенного белка ЭПО человека, только форма гликозилирования очень немного отличается; 3) Период полураспада ЭПО в крови составляет всего 5-6 часов и обычно не обнаруживается через 4-7 дней после последней инъекции; 4) Индивидуальный уровень ЭПО сильно различается, поэтому трудно установить абсолютный количественный стандарт.
С 2000 года ВАДА использует анализ мочи как единственный научный метод проверки прямого обнаружения рекомбинантного ЭПО. Из-за небольших различий между гликоилированной формой искусственного рекомбинантного ЭПО и ЭПО человека заряженные свойства этих двух молекул очень малы, и их можно различить с помощью метода электрофореза, называемого изоэлектрическим фокусированием, который является основной стратегией для прямое обнаружение искусственного рекомбинантного ЭПО. Однако некоторые рекомбинантные ЭПО, экспрессируемые клетками человеческого происхождения, не показали различий в гликозилировании, поэтому некоторые эксперты предположили, что экзогенный ЭПО и эндогенный ЭПО следует различать по различному содержанию изотопов углерода.
На самом деле все еще существуют ограничения в различных методах тестирования ЭПО. Например, Лэнс Армстронг, легенда американского велоспорта, признался, что принимал ЭПО и другие стимуляторы во время своих семи побед на Тур де Франс, но в то время ни в одном допинг-тесте его положительный результат на ЭПО не был подтвержден. Нам все еще нужно подождать и посмотреть, будет ли он «на один фут выше» или «на один фут выше».
Как это делает Нобелевскую премию
Последнее слово о связи между ЭПО и Нобелевской премией по физиологии и медицине 2019 года.
ЭПО является наиболее типичным случаем восприятия и реакции организма человека на гипоксию. Поэтому два лауреата Нобелевской премии Семенца и Рэтклифф выбрали ЭПО в качестве отправной точки для изучения механизма клеточного восприятия и адаптации к гипоксии. Первым шагом было найти элементы гена ЭПО, которые могли бы реагировать на кислородные изменения. Semenza идентифицировала ключевую некодирующую последовательность из 256 оснований на 3'-конце гена, кодирующего EPO, названную элементом ответа на гипоксию. Если последовательность этого элемента мутирована или удалена, способность белка ЕРО реагировать на гипоксию значительно снижается. Если последовательность этого элемента слита с расположенным ниже 3'-концом других генов, не связанных с гипоксией, эти модифицированные гены также проявляют ЭПО-подобную активацию.в условиях гипоксии.
Затем Рэтклифф и его команда обнаружили, что этот элемент реакции на гипоксию присутствует не только в клетках почек или печени, ответственных за выработку ЭПО, но и во многих других типах клеток, которые могут функционировать в условиях гипоксии. Другими словами, этот ответ на гипоксию может быть не специфичным для ЭПО, а скорее более распространенным явлением в клетках. Эти другие клетки, которые не отвечают за выработку ЭПО, должны содержать молекулы (такие как факторы транскрипции, ответственные за включение экспрессии генов), которые ощущают изменения концентрации кислорода и связываются с элементами реакции на гипоксию, чтобы включить такие гены, как ЭПО.
