Trije dobitniki Nobelove nagrade za fiziologijo in medicino leta 2019, William G. Kaelin, ml., Gregg L. Semenza in sir Peter J. Ratcliffe, so že prejeli Laskerjevo nagrado za osnovno medicino leta 2016 za svoje delo o tem, kako celice zaznavajo in se prilagajajo. na hipoksijo, zato ni bilo posebej presenetljivo. Odkrili in identificirali so ključno molekulo hipoksijo inducibilnega faktorja 1 (HIF-1). Danes se želimo vrniti k izvoru študije, ki je eritropoetin ali EPO, čudežna molekula.

Je najpomembnejši dejavnik pri nastajanju rdečih krvnih celic

Rdeče krvničke so najpogostejši tip krvnih celic v krvi in ​​so glavni medij za prenos kisika in ogljikovega dioksida po krvi vretenčarjev. Eritrociti nastajajo v kostnem mozgu: hematopoetske matične celice se najprej razmnožijo in diferencirajo v matične celice različnih krvnih celic, eritroidne matične celice pa se lahko nadalje diferencirajo in dozorijo v eritrocite. V normalnih pogojih je stopnja proizvodnje eritrocitov pri človeku zelo nizka, toda pod stresom, kot so krvavitve, hemoliza in hipoksija, se lahko stopnja proizvodnje eritrocitov poveča do osemkrat. Pri tem procesu je eritropoetin EPO eden najpomembnejših dejavnikov.

EPO je hormon, ki se sintetizira predvsem v ledvicah. Njegova kemična narava je visoko glikozilirana beljakovina. Zakaj v ledvicah? Vsako minuto skozi ledvice preteče približno liter krvi, zato lahko hitro in učinkovito zaznajo spremembe ravni kisika v krvi. Ko so ravni kisika v krvi nizke, se ledvice hitro odzovejo in proizvedejo velike količine EPO. Slednji po krvnem obtoku kroži do kostnega mozga, kjer spodbuja pretvorbo eritroidnih matičnih celic v rdeče krvne celice. Zrele rdeče krvne celice se sprostijo iz kostnega mozga v obtočni sistem, da izboljšajo sposobnost telesa, da se veže na kisik. Ko ledvice zaznajo povečanje kisika v krvi, zmanjšajo proizvodnjo EPO, kar posledično zmanjša količino rdečih krvnih celic v kostnem mozgu.

To naredi popolno prilagoditveno zanko. Vendar pa se ljudje, ki živijo na visoki nadmorski višini, in nekateri bolniki z anemijo pogosto srečujejo s stanjem nenehno nizke ravni kisika v krvi, ki ne more dokončati zgornjega krvnega obtoka in spodbuditi ledvice k neprekinjenemu izločanju EPO, tako da je koncentracija EPO v krvi višja kot pri običajnih ljudeh.

Trajalo je skoraj 80 let, da so ga odkrili

Tako kot mnoga velika odkritja tudi razumevanje EPO s strani znanstvenikov ni potekalo gladko z vprašanji in izzivi na poti. Od koncepta EPO do končne določitve specifične molekule je minilo skoraj 80 let.

Leta 1906 sta francoska znanstvenika Carnot in Deflandre normalnim kuncem vbrizgala serum anemičnih kuncev in ugotovila, da se je število rdečih krvničk v plazmi normalnih kuncev povečalo. Verjeli so, da lahko nekateri humoralni dejavniki v plazmi stimulirajo in uravnavajo nastajanje rdečih krvničk. To je bil prvi konceptni prototip EPO. Na žalost rezultati v naslednjih desetletjih niso bili ponovljeni, predvsem zato, ker število novih rdečih krvničk ni bilo natančno.

Reissmannov in Ruhenstroth-Bauerjev eksperiment s parabiozo leta 1950 je zagotovil res močne dokaze. Kirurško so povezali krvožilni sistem dveh živih podgan, tako da so eno postavili v hipoksično okolje, drugo pa so dihale normalen zrak. Posledično sta obe miši proizvedli ogromne količine rdečih krvnih celic. Nobenega dvoma ni, da je v krvnem obtoku hormon, ki spodbuja nastajanje rdečih krvničk, po katerem je EPO dobil ime. Po drugi strani pa je EPO zelo občutljiv na hipoksijo.

Katera molekula je EPO? Ameriški znanstvenik Goldwasser je potreboval 30 let, da je problem končno razjasnil na biokemični ravni. Če hoče delavec dobro opraviti delo, mora najprej nabrusiti svoje orodje. Funkcija EPO je stimulacija novih rdečih krvničk, vendarštetje slednjih ni točno. Najpomembnejša funkcionalna molekula v rdečih krvničkah je hemoglobin, ki vsebuje hem, ki v središču vsebuje železov ion. Tako je Goldwasserjeva ekipa označila rdeče krvne celice novorojenčkov z radioaktivnimi izotopi železa in razvila občutljivo metodo za odkrivanje aktivnosti EPO. To omogoča izolacijo in čiščenje zelo nizkih koncentracij EPO (nanogramov na mililiter) iz vzorcev živalskih tekočin. Toda izolacija EPO je bila izjemno težka. Prešli so z ledvične na anemično ovčjo plazmo, na urin bolnikov s hudim pomanjkanjem železa zaradi okužbe s kavljastimi glistami in končno leta 1977 očistili 8 miligramov človeškega proteina EPO iz 2550 litrov urina japonskih bolnikov z aplastično anemijo.

Leta 1985 je bilo dokončano proteinsko sekvenciranje in gensko kloniranje človeškega EPO. Gen EPO kodira polipeptid s 193 amino ostanki, ki postane zrel protein, sestavljen iz 166 aminokislinskih ostankov, potem ko je signalni peptid odrezan med izločanjem, in vsebuje 4 mesta za modifikacijo glikozilacije. Leta 1998 so analizirali NMR strukturo raztopine EPO ter kristalno strukturo EPO in njegovega receptorskega kompleksa. Na tej točki imajo ljudje najbolj intuitivno razumevanje EPO.

Do zdaj je zdravljenje anemije običajno zahtevalo transfuzijo krvi za nadomestitev pomanjkanja rdečih krvnih celic. Ko ljudje izvedo več o EPO, je njegovo injiciranje za spodbujanje proizvodnje rdečih krvnih celic v lastnem kostnem mozgu olajšalo težavo. Toda čiščenje EPO neposredno iz telesnih tekočin, kot je to storil Goldwasser, je težko in izkoristki so nizki. Določitev proteina EPO in genske sekvence je omogočila proizvodnjo rekombinantnega humanega EPO v velikih količinah.

Izvedlo ga je biotehnološko podjetje Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen je bil ustanovljen leta 1980 s samo sedmimi člani v upanju, da bo izdeloval biofarmacevtske izdelke s takrat nastajajočimi tehnikami molekularne biologije. Interferon, faktor sproščanja rastnega hormona, cepivo proti hepatitisu B, epidermalni rastni faktor so bili med vročimi imeni na njihovem seznamu tarč, vendar noben od teh poskusov ni uspel. Do leta 1985 je Lin Fukun, kitajski znanstvenik iz Tajvana na Kitajskem, kloniral gen človeškega EPO in nato s tehnologijo rekombinacije DNK izvedel proizvodnjo sintetičnega EPO.

Rekombinantni humani EPO ima enako sekvenco kot endogeni protein EPO in ima tudi podobno modifikacijo glikozilacije. Seveda ima rekombinantni humani EPO tudi aktivnost endogenega EPO. Junija 1989 je ameriška FDA odobrila prvi Amgenov izdelek, rekombinantni humani eritropoetin Epogen, za zdravljenje anemije, ki jo povzroča kronična odpoved ledvic in anemije pri zdravljenju okužbe s HIV. Prodaja Epogena je v samo treh mesecih presegla 16 milijonov dolarjev. V naslednjih dveh desetletjih je Amgen prevladoval na trgu ponovno sestavljenega človeškega EPO. Epogen je Amgenu samo v letu 2010 prinesel 2,5 milijarde dolarjev prihodkov. Leta 2018 je borzna vrednost Amgena znašala 128,8 milijarde dolarjev, s čimer je bilo osmo največje farmacevtsko podjetje na svetu.

Omeniti velja, da je Amgen sprva sodeloval z Goldwasserjem, da bi zagotovil prečiščene človeške proteine ​​EPO za sekvenciranje, vendar sta se Goldwasser in Amgen kmalu sprla zaradi ideoloških razlik. Goldwasser in njegova Univerza v Chicagu, ki je izvajala temeljne raziskave, nista nikoli pomislila, da bi patentirala hormon, ki ga je odkril, in tako nista prejela niti penija za velik komercialni uspeh EPO.

Kako je to stimulans

Ko dihamo, vstopi kisik v mitohondrije celic, da poganja dihalno verigo in proizvaja ogromne količine ATP, ki je glavni vir energije v našem telesu. Anemični ljudje nimajo dovolj zdravih rdečih krvničk, najbolj takojšen učinek pa je, da ne zaužijejo dovolj kisika, zaradi česar se počutijo utrujeni, podobno kot težave z dihanjem pri daljšem teku. Po injiciranju rekombinantnega humanega EPO telo bolnikov z anemijo proizvede več rdečih krvnih celic,prenašajo več kisika in proizvajajo več energijske molekule ATP, kar učinkovito lajša simptome.

Nekateri športni delavci pa so začeli razmišljati tudi o rekombinantnem človeškem EPO. Če uporabimo umetni rekombinantni hormon tipa EPO za spodbujanje športnikovega telesa, da proizvede več rdečih krvnih celic, je mogoče izboljšati sposobnost športnikov za pridobivanje kisika in proizvodnjo energijskih molekul, kar lahko izboljša tudi zmogljivost športnikov v vzdržljivosti. prireditve, kot so kolesarjenje, tek na dolge proge in tek na smučeh. Članek iz leta 1980 v Journal of Applied Physiology je pokazal, da lahko krvni stimulansi (eritropoetin, umetni prenašalci kisika in transfuzije krvi) povečajo vzdržljivost za 34 odstotkov. Če športniki uporabljajo EPO, lahko pretečejo 8 kilometrov na tekalni stezi v 44 sekundah krajšem času kot prej. Pravzaprav sta bila kolesarjenje in maraton najhujša škoda za stimulanse EPO. Med Dirko po Franciji leta 1998 je bil zdravnik španske ekipe Festina aretiran na francoski meji s 400 steklenicami umetnega rekombinantnega EPO! Posledica tega je bila seveda ta, da je bila celotna ekipa izločena s Toura in prepovedana.

Mednarodni olimpijski komite je dodal EPO na svoj seznam prepovedanih na igrah v Barceloni leta 1992, vendar je bila reorganizacija testiranja EPO na ljudeh tako težavna, da pred igrami leta 2000 ni bilo nobenega načina za učinkovito odkrivanje, ali ga športniki uporabljajo. Razlogov je več: 1) vsebnost EPO v telesnih tekočinah je zelo nizka in EPO na ml krvi pri normalnih ljudeh znaša približno 130-230 nanogramov; 2) Aminokislinska sestava umetnega rekombinantnega EPO je popolnoma enaka sestavi človeškega endogenega proteina EPO, le oblika glikozilacije je zelo malo drugačna; 3) Razpolovni čas EPO v krvi je samo 5-6 ur in ga na splošno ni mogoče zaznati 4-7 dni po zadnji injekciji; 4) Posamezna raven EPO je zelo različna, zato je težko določiti absolutni kvantitativni standard.

Od leta 2000 WADA uporablja testiranje urina kot edino znanstveno verifikacijsko metodo za neposredno odkrivanje rekombinantnega EPO. Zaradi majhnih razlik med glikoilirano obliko umetnega rekombinantnega EPO in obliko človeškega EPO so nabite lastnosti obeh molekul zelo majhne in jih je mogoče razlikovati z metodo elektroforeze, imenovano izoelektrično fokusiranje, ki je glavna strategija za neposredno detekcijo umetnega rekombinantnega EPO. Vendar nekateri rekombinantni EPO, izražen s celicami človeškega izvora, niso pokazali razlike v glikozilaciji, zato so nekateri strokovnjaki predlagali, da bi bilo treba eksogeni EPO in endogeni EPO razlikovati po različni vsebnosti izotopov ogljika.

Pravzaprav še vedno obstajajo omejitve pri različnih metodah testiranja EPO. Na primer, Lance Armstrong, ameriška kolesarska legenda, je priznal, da je jemal EPO in druga poživila med svojimi sedmimi zmagami na Tour de France, vendar v tem času na nobenem dopinškem testu dejansko ni bil potrjeno pozitiven na EPO. Še vedno moramo počakati in videti, ali je "eno nogo višje" ali "eno nogo višje".

Kako to naredi Nobelovo nagrado

Še zadnja beseda o povezavi med EPO in Nobelovo nagrado za fiziologijo in medicino leta 2019.

EPO je najbolj značilen primer zaznave in odziva človeškega telesa na hipoksijo. Zato sta Nobelova nagrajenca Semenza in Ratcliffe izbrala EPO kot izhodišče za preučevanje mehanizma zaznavanja in prilagajanja celic na hipoksijo. Prvi korak je bil najti elemente gena EPO, ki bi se lahko odzvali na spremembe kisika. Semenza je identificiral ključno nekodirajoče zaporedje s 256 bazami na 3' spodnjem koncu gena, ki kodira EPO, imenovano element odziva na hipoksijo. Če je to zaporedje elementov mutirano ali izbrisano, je sposobnost proteina EPO, da se odzove na hipoksijo, močno zmanjšana. Če je to zaporedje elementov spojeno s spodnjim 3' koncem drugih genov, ki niso povezani s hipoksijo, tudi ti spremenjeni geni kažejo EPO podobno aktivacijov pogojih hipoksije.

Ratcliffe in njegova ekipa sta nato odkrila, da ta element hipoksičnega odziva ni prisoten le v celicah ledvic ali jeter, ki so odgovorne za proizvodnjo EPO, ampak tudi v mnogih drugih tipih celic, ki lahko delujejo v hipoksičnih pogojih. Z drugimi besedami, ta odziv na hipoksijo morda ni specifičen za EPO, temveč bolj razširjen pojav v celicah. Te druge celice, ki niso odgovorne za proizvodnjo EPO, morajo vsebovati molekule (kot so transkripcijski faktorji, odgovorni za vklop izražanja genov), ki zaznavajo spremembe v koncentraciji kisika in se vežejo na elemente hipoksičnega odziva, da vklopijo gene, kot je EPO.