Tre fituesit e çmimit Nobel 2019 në Fiziologji ose Mjekësi, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza dhe Sir Peter J. Ratcliffe kishin fituar tashmë çmimin Lasker 2016 në Mjekësinë Bazë për punën e tyre mbi mënyrën se si qelizat ndjejnë dhe përshtaten. në hipoksi, kështu që nuk ishte veçanërisht befasuese. Ata zbuluan dhe identifikuan molekulën kryesore faktorin 1 të induktueshëm nga hipoksia (HIF-1). Sot duam të kthehemi te origjina e studimit, që është eritropoetina, ose EPO, një molekulë mrekullie.

Është faktori më i rëndësishëm në prodhimin e qelizave të kuqe të gjakut

Qelizat e kuqe të gjakut janë lloji më i bollshëm i qelizave të gjakut në gjak dhe janë mjeti kryesor për transportimin e oksigjenit dhe dioksidit të karbonit përmes gjakut të vertebrorëve. Eritrocitet krijohen në palcën e eshtrave: qelizat staminale hematopoietike fillimisht shumohen dhe diferencohen në paraardhës të qelizave të ndryshme të gjakut, dhe paraardhësit eritroide mund të diferencohen më tej dhe të maturohen në eritrocite. Në kushte normale, shkalla e prodhimit të eritrociteve të njeriut është shumë e ulët, por nën stres të tillë si gjakderdhja, hemoliza dhe hipoksia, shkalla e prodhimit të eritrociteve mund të rritet deri në tetë herë. Në këtë proces, eritropoetina EPO është një nga faktorët më të rëndësishëm.

EPO është një hormon i sintetizuar kryesisht në veshka. Natyra e saj kimike është një proteinë shumë e glikoziluar. Pse në veshka? Rreth një litër gjak rrjedh nëpër veshka çdo minutë, kështu që ato mund të zbulojnë shpejt dhe me efikasitet ndryshimet në nivelet e oksigjenit në gjak. Kur nivelet e oksigjenit në gjak janë të ulëta, veshkat reagojnë shpejt dhe prodhojnë sasi të mëdha EPO. Ky i fundit qarkullon përmes qarkullimit të gjakut në palcën e eshtrave, ku nxit shndërrimin e qelizave pararendëse eritroide në qeliza të kuqe të gjakut. Qelizat e kuqe të gjakut të pjekura lëshohen nga palca e eshtrave në sistemin e qarkullimit të gjakut për të përmirësuar aftësinë e trupit për t'u lidhur me oksigjenin. Kur veshkat ndjejnë një rritje të oksigjenit në gjak, ato zvogëlojnë prodhimin e EPO, i cili nga ana tjetër zvogëlon sasinë e qelizave të kuqe të gjakut në palcën e eshtrave.

Kjo krijon një lak të përsosur rregullimi. Megjithatë, njerëzit që jetojnë në lartësi të mëdha dhe disa pacientë me anemi shpesh hasin në gjendjen e nivelit të vazhdueshëm të ulët të oksigjenit në gjak, i cili nuk mund të përfundojë qarkullimin e mësipërm dhe të stimulojë veshkat për të sekretuar vazhdimisht EPO, në mënyrë që përqendrimi i EPO në gjak të jetë më i lartë se njerëzit e zakonshëm.

U deshën gati 80 vjet për ta zbuluar atë

Ashtu si shumë zbulime të mëdha, të kuptuarit e shkencëtarëve për EPO nuk ka qenë i qetë, me pyetje dhe sfida gjatë rrugës. U deshën gati 80 vjet nga koncepti i EPO deri në përcaktimin përfundimtar të molekulës specifike.

Në vitin 1906, shkencëtarët francezë Carnot dhe Deflandre injektuan lepujt normalë me serumin e lepujve anemikë dhe zbuluan se numri i qelizave të kuqe të gjakut në plazmën e lepujve normalë u rrit. Ata besonin se disa faktorë humoralë në plazmë mund të stimulonin dhe rregullonin prodhimin e qelizave të kuqe të gjakut. Ky ishte prototipi i parë i konceptit EPO. Fatkeqësisht, rezultatet nuk janë përsëritur në dekadat e mëvonshme, kryesisht për shkak se numërimi i qelizave të reja të kuqe të gjakut nuk ishte i saktë.

Eksperimenti i parabiozës i Reissmann dhe Ruhenstroth-Bauer në vitin 1950 dha prova vërtet të forta. Ata lidhën në mënyrë kirurgjikale sistemet e qarkullimit të gjakut të dy minjve të gjallë, duke e vendosur njërin në një mjedis hipoksi dhe tjetrin duke thithur ajër normal. Si rezultat, të dy minjtë prodhuan sasi masive të qelizave të kuqe të gjakut. Nuk ka dyshim se në qarkullimin e gjakut ekziston një hormon që stimulon prodhimin e rruazave të kuqe të gjakut, nga i cili ka marrë emrin EPO. Nga ana tjetër, EPO është shumë e ndjeshme ndaj hipoksisë.

Çfarë molekule është EPO? Shkencëtarit amerikan Goldwasser iu deshën 30 vjet për të sqaruar përfundimisht problemin në nivel biokimik. Nëse një punëtor dëshiron të bëjë një punë të mirë, fillimisht duhet të mprehë veglat e tij. Funksioni i EPO është të stimulojë qelizat e reja të kuqe të gjakut, pornumërimi i kësaj të fundit nuk është i saktë. Molekula më e rëndësishme funksionale në qelizat e kuqe të gjakut është hemoglobinë që përmban hemin, i cili përmban një jon hekuri në qendër. Kështu që ekipi i Goldwasser etiketoi qelizat e kuqe të gjakut të porsalindur me izotope hekuri radioaktiv dhe zhvilloi një metodë të ndjeshme për zbulimin e aktivitetit të EPO. Kjo bën të mundur izolimin dhe pastrimin e përqendrimeve shumë të ulëta të EPO (nanogramë për mililitër) nga mostrat e lëngjeve të kafshëve. Por izolimi i EPO ishte jashtëzakonisht i vështirë. Ata kaluan nga plazma e veshkave në plazmën anemike të deleve, në urinën e pacientëve me mungesë të rëndë hekuri për shkak të infeksionit të krimbit të gjilpërave dhe më në fund, në 1977, pastruan 8 miligramë proteinë njerëzore EPO nga 2550 litra urinë nga pacientët japonezë me anemi aplastike.

Në vitin 1985, përfundoi sekuenca e proteinave dhe klonimi i gjeneve të EPO-së njerëzore. Gjeni EPO kodon një polipeptid me 193 mbetje amino, i cili bëhet një proteinë e pjekur e përbërë nga 166 mbetje aminoacide pasi peptidi sinjalizohet gjatë sekretimit dhe përmban 4 vende për modifikimin e glikozilimit. Në vitin 1998, u analizuan struktura e zgjidhjes NMR të EPO dhe struktura kristalore e EPO dhe kompleksi i receptorit të saj. Në këtë pikë, njerëzit kanë kuptimin më intuitiv të EPO.

Deri më tani, trajtimi për aneminë zakonisht kërkonte transfuzion gjaku për të rimbushur mungesën e qelizave të kuqe të gjakut. Ndërsa njerëzit mësojnë më shumë rreth EPO, injektimi i saj për të stimuluar prodhimin e qelizave të kuqe të gjakut në palcën e tyre kockore e ka bërë problemin më të lehtë. Por pastrimi i EPO direkt nga lëngjet e trupit, siç bëri Goldwasser, është i vështirë dhe rendimentet janë të ulëta. Përcaktimi i proteinës EPO dhe sekuenca e gjeneve bëri të mundur prodhimin e EPO njerëzore rekombinante në sasi të mëdha.

Është bërë nga një kompani bioteknologjike e quajtur Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen u themelua në vitin 1980 me vetëm shtatë anëtarë, duke shpresuar të prodhojë biofarmaceutikë me teknikat e biologjisë molekulare të atëhershme. Interferoni, faktori çlirues i hormonit të rritjes, vaksina e hepatitit B, faktori i rritjes së epidermës ishin ndër emrat e nxehtë në listën e tyre të objektivave, por asnjë nga këto përpjekje nuk pati sukses. Deri në vitin 1985, Lin Fukun, një shkencëtar kinez nga Tajvani, Kinë, klonoi gjenin e EPO-së njerëzore dhe më pas realizoi prodhimin e EPO sintetike duke përdorur teknologjinë e rikombinimit të ADN-së.

EPO njerëzore rekombinante ka të njëjtën sekuencë si proteina EPO endogjene, dhe gjithashtu ka modifikim të ngjashëm të glikozilimit. Natyrisht, EPO njerëzore rekombinante ka gjithashtu aktivitetin e EPO endogjene. Në qershor të vitit 1989, produkti i parë i Amgen, eritropoietina humane rekombinante Epogen, u miratua nga FDA e SHBA për trajtimin e anemisë së shkaktuar nga dështimi kronik i veshkave dhe anemisë në trajtimin e infeksionit HIV. Shitjet e Epogen arritën në 16 milionë dollarë në vetëm tre muaj. Gjatë dy dekadave të ardhshme, Amgen dominoi tregun për EPO njerëzore të rimontuar. Epogen i solli Amgen 2.5 miliardë dollarë të ardhura vetëm në vitin 2010. Në vitin 2018, vlera e tregut të aksioneve të Amgen ishte 128.8 miliardë dollarë, duke e bërë atë kompaninë e tetë farmaceutike më të madhe në botë.

Vlen të përmendet se Amgen fillimisht punoi me Goldwasser për të siguruar proteina të pastruara EPO njerëzore për sekuencë, por Goldwasser dhe Amgen shpejt ranë jashtë për shkak të dallimeve ideologjike. Goldwasser dhe Universiteti i tij i Çikagos, të cilët bënë kërkime bazë, nuk menduan kurrë të patentojnë hormonin që ai zbuloi, dhe kështu nuk kanë marrë asnjë qindarkë për suksesin e madh komercial të EPO.

Ajo -- si është një stimulues

Kur marrim frymë, oksigjeni hyn në mitokondritë e qelizave për të drejtuar zinxhirin e frymëmarrjes dhe për të prodhuar sasi masive të ATP, burimi kryesor i energjisë në trupin tonë. Njerëzit anemikë nuk kanë mjaftueshëm qeliza të kuqe të shëndetshme të gjakut dhe efekti më i menjëhershëm është se ata nuk marrin mjaftueshëm oksigjen, gjë që i bën ata të ndihen të lodhur, ngjashëm me problemet e frymëmarrjes gjatë një vrapimi të gjatë. Kur injektohet me EPO njerëzore rekombinante, trupat e pacientëve me anemi prodhojnë më shumë qeliza të kuqe të gjakut,bartin më shumë oksigjen dhe prodhojnë më shumë molekulën e energjisë ATP, duke lehtësuar në mënyrë efektive simptomat.

Sidoqoftë, disa punonjës sportivë kanë filluar të mendojnë edhe për EPO njerëzore rekombinuese. Nëse hormoni artificial rikombinant i tipit EPO përdoret për të stimuluar trupin e atletëve për të prodhuar më shumë qeliza të kuqe të gjakut, është e mundur të përmirësohet aftësia e atletëve për të marrë oksigjen dhe për të prodhuar molekula energjie, të cilat gjithashtu mund të përmirësojnë performancën e atletëve në qëndrueshmëri. ngjarje të tilla si çiklizmi, vrapimi në distanca të gjata dhe skijimi në vend. Një punim i vitit 1980 në Journal of Applied Physiology tregoi se stimuluesit e gjakut (eritropoetina, transportuesit artificialë të oksigjenit dhe transfuzionet e gjakut) mund të rrisin qëndrueshmërinë me 34 përqind. Nëse atletët përdorin EPO, ata mund të vrapojnë 8 kilometra në rutine në 44 sekonda më pak kohë se më parë. Në fakt, çiklizmi dhe maratonat kanë qenë shkelësit më të keq për stimuluesit EPO. Gjatë Tour de France 1998, një mjek i ekipit spanjoll për ekipin Festina u arrestua në kufirin francez me 400 shishe EPO artificiale rekombinante! Rezultati, natyrisht, ishte që i gjithë ekipi u përjashtua nga Tour dhe u ndalua.

Komiteti Olimpik Ndërkombëtar e shtoi EPO në listën e tij të ndaluar në Lojërat e Barcelonës 1992, por riorganizimi i testimit të EPO-së njerëzore ishte aq i vështirë sa që para Lojërave të 2000 nuk kishte asnjë mënyrë për të zbuluar në mënyrë efektive nëse atletët po e përdornin atë. Ka disa arsye: 1) Përmbajtja e EPO në lëngjet e trupit është shumë e ulët dhe EPO për ml gjak te njerëzit normalë është rreth 130-230 nanogram; 2) Përbërja e aminoacideve të EPO artificiale rikombinante është saktësisht e njëjtë me atë të proteinës EPO endogjene njerëzore, vetëm forma e glikozilimit është shumë pak e ndryshme; 3) Gjysma e jetës së EPO në gjak është vetëm 5-6 orë, dhe në përgjithësi është e pazbulueshme 4-7 ditë pas injektimit të fundit; 4) Niveli individual i EPO është shumë i ndryshëm, kështu që është e vështirë të vendosësh një standard sasior absolut.

Që nga viti 2000, WADA ka përdorur testimin e urinës si metodën e vetme të verifikimit shkencor për zbulimin e drejtpërdrejtë të EPO-së rekombinante. Për shkak të dallimeve të lehta midis formës së glikoiluar të EPO-së artificiale rekombinante dhe asaj të EPO-së njerëzore, vetitë e ngarkuara të dy molekulave janë shumë të vogla dhe mund të dallohen nga një metodë elektroforeze e quajtur fokusimi izoelektrik, e cila është strategjia kryesore për zbulimi i drejtpërdrejtë i EPO-së artificiale rekombinante. Megjithatë, disa EPO rekombinante të shprehura nga qelizat me prejardhje njerëzore nuk treguan asnjë ndryshim në glikozilim, kështu që disa ekspertë sugjeruan që EPO ekzogjene dhe EPO endogjene duhet të dallohen nga përmbajtja e ndryshme e izotopeve të karbonit.

Në fakt, ka ende kufizime në metodat e ndryshme të testimit për EPO. Për shembull, Lance Armstrong, legjenda amerikane e çiklizmit, pranoi se kishte marrë EPO dhe stimulues të tjerë gjatë shtatë fitoreve të tij në Tour de France, por ai nuk u konfirmua pozitiv për EPO në asnjë test doping në atë kohë. Duhet të presim akoma dhe të shohim nëse është "një këmbë më lart" apo "një këmbë më lart".

Si e bën atë një çmim Nobel

Një fjalë e fundit për lidhjen midis EPO dhe Çmimit Nobel 2019 në Fiziologji ose Mjekësi.

EPO është rasti më tipik i perceptimit dhe reagimit të trupit të njeriut ndaj hipoksisë. Prandaj, Semenza dhe Ratcliffe, dy laureatë të Nobelit, zgjodhën EPO-në si pikënisje për të studiuar mekanizmin e perceptimit të qelizave dhe përshtatjes ndaj hipoksisë. Hapi i parë ishte gjetja e elementeve të gjenit EPO që mund t'i përgjigjen ndryshimeve të oksigjenit. Semenza identifikoi një sekuencë kyçe jo-koduese me 256 bazë në fundin 3 'të poshtëm të gjenit që kodon EPO, i quajtur elementi i përgjigjes së hipoksisë. Nëse kjo sekuencë e elementeve mutohet ose fshihet, aftësia e proteinës EPO për t'iu përgjigjur hipoksisë zvogëlohet shumë. Nëse kjo sekuencë elementesh shkrihet në fundin 3' të gjeneve të tjera që nuk shoqërohen me hipoksi, këto gjene të modifikuara tregojnë gjithashtu aktivizim të ngjashëm me EPOnë kushte hipoksi.

Ratcliffe dhe ekipi i tij më pas zbuluan se ky element i reagimit hipoksik nuk është i pranishëm vetëm në qelizat e veshkave ose të mëlçisë përgjegjëse për prodhimin e EPO, por edhe në shumë lloje të tjera qelizash që mund të funksionojnë në kushte hipoksi. Me fjalë të tjera, kjo përgjigje ndaj hipoksisë mund të mos jetë specifike për EPO, por një fenomen më i përhapur në qeliza. Këto qeliza të tjera, të cilat nuk janë përgjegjëse për prodhimin e EPO, duhet të përmbajnë molekula (të tilla si faktorët e transkriptimit përgjegjës për ndezjen e shprehjes së gjeneve) që ndjejnë ndryshimet në përqendrimin e oksigjenit dhe lidhen me elementët e reagimit hipoksik për të ndezur gjenet si EPO.