Тројица добитника Нобелове награде за физиологију или медицину 2019. године, Вилијам Г. Кејлин, млађи, Грег Л. Семенца и сер Питер Џеј Ретклиф, већ су добили Ласкерову награду за основну медицину 2016. за свој рад на томе како ћелије осећају и прилагођавају се до хипоксије, тако да није било посебно изненађујуће. Они су открили и идентификовали кључни молекул фактор 1 који изазива хипоксију (ХИФ-1). Данас желимо да се вратимо на порекло студије, а то је еритропоетин, или ЕПО, чудотворни молекул.

То је најважнији фактор у производњи црвених крвних зрнаца

Црвена крвна зрнца су најзаступљенија врста крвних зрнаца у крви и главни су медијум за транспорт кисеоника и угљен-диоксида кроз крв кичмењака. Еритроцити се стварају у коштаној сржи: хематопоетске матичне ћелије се прво размножавају и диференцирају у прогениторе различитих крвних ћелија, а еритроидни прогенитори могу даље да се диференцирају и сазревају у еритроците. У нормалним условима, стопа производње еритроцита код људи је веома ниска, али под стресом као што су крварење, хемолиза и хипоксија, стопа производње еритроцита може да се повећа до осам пута. У овом процесу, еритропоетин ЕПО је један од најважнијих фактора.

ЕПО је хормон који се синтетише углавном у бубрезима. Његова хемијска природа је високо гликозиловани протеин. Зашто у бубрезима? Сваког минута кроз бубреге протиче око литар крви, тако да могу брзо и ефикасно да открију промене нивоа кисеоника у крви. Када је ниво кисеоника у крви низак, бубрези брзо реагују и производе велике количине ЕПО. Потоњи циркулише кроз крвоток до коштане сржи, где промовише претварање еритроидних прогенитор ћелија у црвена крвна зрнца. Зрела црвена крвна зрнца се ослобађају из коштане сржи у циркулаторни систем како би се побољшала способност тела да се везује за кисеоник. Када бубрези осете повећање кисеоника у крви, они смањују производњу ЕПО, што заузврат смањује количину црвених крвних зрнаца у коштаној сржи.

Ово чини савршену петљу за подешавање. Међутим, људи који живе на високој надморској висини и неки пацијенти са анемијом често се сусрећу са стањем континуирано ниског нивоа кисеоника у крви, који не може да доврши горњу циркулацију и стимулише бубрег да континуирано лучи ЕПО, тако да је концентрација ЕПО у крви већа од обичних људи.

Било је потребно скоро 80 ​​година да се то открије

Као и многа велика открића, разумевање ЕПО-а од стране научника није било глатко, са питањима и изазовима на том путу. Било је потребно скоро 80 ​​година од концепта ЕПО до коначног одређивања специфичног молекула.

Године 1906. француски научници Карно и Дефландре убризгали су нормалним зечевима серум анемичних зечева и открили да се повећао број црвених крвних зрнаца у плазми нормалних зечева. Они су веровали да неки хуморални фактори у плазми могу да стимулишу и регулишу производњу црвених крвних зрнаца. Ово је био први прототип концепта ЕПО. Нажалост, резултати се нису поновили у наредним деценијама, углавном зато што број нових црвених крвних зрнаца није био тачан.

Рајсманов и Руенстрот-Бауеров експеримент парабиозе 1950. пружио је заиста јаке доказе. Они су хируршким путем повезали циркулаторни систем два жива пацова, стављајући једног у хипоксичну средину, а другог удишући нормалан ваздух. Као резултат тога, оба миша су произвела огромне количине црвених крвних зрнаца. Нема сумње да у крвотоку постоји хормон који стимулише производњу црвених крвних зрнаца, по чему је ЕПО добио име. С друге стране, ЕПО је веома осетљив на хипоксију.

Који је молекул ЕПО? Америчком научнику Голдвасеру је требало 30 година да коначно разјасни проблем на биохемијском нивоу. Ако радник жели да уради добар посао, прво мора да наоштри свој алат. Функција ЕПО је да стимулише нова црвена крвна зрнца, алиброј ових последњих није тачан. Најважнији функционални молекул у црвеним крвним зрнцима је хем који садржи хемоглобин, који садржи јон гвожђа у свом центру. Тако је Голдвасеров тим означио новорођена црвена крвна зрнца радиоактивним изотопима гвожђа и развио осетљиву методу за откривање активности ЕПО. Ово омогућава да се изолују и пречисте веома ниске концентрације ЕПО (нанограми по милилитру) из узорака животињских течности. Али изолација ЕПО-а је била изузетно тешка. Прешли су са бубрежне на анемијску овчију плазму, на урин пацијената са тешким недостатком гвожђа услед инфекције анкилостоми, и коначно, 1977. године, пречистили су 8 милиграма хуманог ЕПО протеина из 2.550 литара урина јапанских пацијената са апластичном анемијом.

Године 1985. завршено је секвенцирање протеина и клонирање гена хуманог ЕПО. ЕПО ген кодира полипептид са 193 амино остатка, који постаје зрео протеин састављен од 166 аминокиселинских остатака након што је сигнални пептид одсечен током секреције, и садржи 4 места за модификацију гликозилације. Године 1998. анализирана је структура НМР раствора ЕПО и кристална структура ЕПО и његовог рецепторског комплекса. У овом тренутку, људи имају најинтуитивније разумевање ЕПО.

До сада је лечење анемије обично захтевало трансфузију крви да би се надокнадио недостатак црвених крвних зрнаца. Како људи сазнају више о ЕПО-у, његово убризгавање да би се стимулисало стварање црвених крвних зрнаца у сопственој коштаној сржи је олакшало проблем. Али пречишћавање ЕПО директно из телесних течности, као што је то урадио Голдвасер, је тешко и приноси су мали. Одређивање ЕПО протеина и секвенце гена омогућило је производњу рекомбинантног хуманог ЕПО у великим количинама.

То је урадила биотехнолошка компанија под називом Апплиед Молецулар Генетицс (Амген). Амген је основан 1980. године са само седам чланова, надајући се да ће производити биофармацеутике помоћу техника молекуларне биологије које су тада биле у настајању. Интерферон, фактор ослобађања хормона раста, вакцина против хепатитиса Б, епидермални фактор раста били су међу врућим именима на њиховој листи мета, али ниједан од ових покушаја није успео. До 1985. године, Лин Фукун, кинески научник са Тајвана, Кина, клонирао је ген људског ЕПО, а затим реализовао производњу синтетичког ЕПО користећи технологију рекомбинације ДНК.

Рекомбинантни хумани ЕПО има исту секвенцу као ендогени ЕПО протеин, а такође има сличну модификацију гликозилације. Наравно, рекомбинантни хумани ЕПО такође има активност ендогеног ЕПО. У јуну 1989. године, први Амгенов производ, рекомбинантни хумани еритропоетин Епоген, одобрен је од стране америчке ФДА за лечење анемије изазване хроничном бубрежном инсуфицијенцијом и анемијом у лечењу ХИВ инфекције. Продаја Епогена премашила је 16 милиона долара за само три месеца. Током наредне две деценије, Амген је доминирао тржиштем поново састављених људских ЕПО. Епоген је само у 2010. донео Амгену 2,5 милијарди долара прихода. У 2018. тржишна вредност Амгена била је 128,8 милијарди долара, што га чини осмом по величини фармацеутском компанијом на свету.

Вреди напоменути да је Амген у почетку радио са Голдвасером на обезбеђивању пречишћених људских ЕПО протеина за секвенцирање, али су Голдвасер и Амген убрзо испали због идеолошких разлика. Голдвасер и његов Универзитет у Чикагу, који су радили основна истраживања, никада нису помислили да патентирају хормон који је открио, па нису добили ни пени за огроман комерцијални успех ЕПО-а.

То -- како је то стимуланс

Када дишемо, кисеоник улази у митохондрије ћелија да покреће респираторни ланац и производи огромне количине АТП-а, главног извора енергије у нашим телима. Анемични људи немају довољно здравих црвених крвних зрнаца, а најнепосреднији ефекат је да не уносе довољно кисеоника, због чега се осећају уморно, слично проблемима са дисањем током дужег трчања. Када се убризгава рекомбинантни хумани ЕПО, тела пацијената са анемијом производе више црвених крвних зрнаца,носе више кисеоника и производе више енергетског молекула АТП, ефикасно ублажавајући симптоме.

Међутим, неки спортски радници су такође почели да размишљају о рекомбинантном људском ЕПО. Ако се вештачки рекомбинантни хормон типа ЕПО користи да стимулише тело спортиста да производи више црвених крвних зрнаца, могуће је побољшати способност спортиста да добију кисеоник и производе молекуле енергије, што такође може побољшати перформансе спортиста у издржљивости. догађаји као што су бициклизам, трчање на дуге стазе и скијашко трчање. Рад из 1980. у часопису Јоурнал оф Апплиед Пхисиологи показао је да стимуланси крви (еритропоетин, вештачки носачи кисеоника и трансфузије крви) могу повећати издржљивост за 34 процента. Ако спортисти користе ЕПО, могу трчати 8 километара на траци за трчање за 44 секунде мање времена него раније. У ствари, бициклизам и маратон су били најгори преступници за ЕПО стимулансе. Током Тур де Франса 1998. године, шпански лекар тима Фестина је ухапшен на француској граници са 400 боца вештачког рекомбинантног ЕПО! Резултат је, наравно, био да је цео тим избачен са Тура и забрањен.

Међународни олимпијски комитет је додао ЕПО на своју забрањену листу на Играма у Барселони 1992. године, али је реорганизација тестирања ЕПО код људи била толико тешка да пре Игара 2000. није било начина да се ефикасно открије да ли га спортисти користе. Постоји неколико разлога: 1) Садржај ЕПО у телесним течностима је веома низак, а ЕПО по мл крви код нормалних људи износи око 130-230 нанограма; 2) Састав аминокиселина вештачког рекомбинантног ЕПО је потпуно исти као и хуманог ендогеног ЕПО протеина, само се облик гликозилације веома мало разликује; 3) Полуживот ЕПО у крви је само 5-6 сати, а генерално се не може детектовати 4-7 дана након последње ињекције; 4) Појединачни ниво ЕПО је веома различит, тако да је тешко успоставити апсолутни квантитативни стандард.

Од 2000. ВАДА користи тестирање урина као једину научну методу верификације за директну детекцију рекомбинантног ЕПО. Због малих разлика између гликоилованог облика вештачког рекомбинантног ЕПО и људског ЕПО, својства наелектрисања два молекула су веома мала и могу се разликовати методом електрофорезе која се назива изоелектрично фокусирање, што је главна стратегија за директна детекција вештачког рекомбинантног ЕПО. Међутим, неки рекомбинантни ЕПО експримирани у ћелијама добијеним од човека нису показали никакву разлику у гликозилацији, тако да су неки стручњаци сугерисали да егзогени ЕПО и ендогени ЕПО треба разликовати по различитом садржају изотопа угљеника.

У ствари, још увек постоје ограничења у различитим методама тестирања за ЕПО. На пример, Ленс Армстронг, америчка бициклистичка легенда, признао је да је узимао ЕПО и друге стимулансе током својих седам победа на Тур де Франсу, али заправо није био позитиван на ЕПО ни на једном допинг тесту у то време. Остаје да сачекамо да видимо да ли је „једну стопу више” или „једну стопу више”.

Како то доноси Нобелову награду

Последња реч о вези између ЕПО-а и Нобелове награде за физиологију или медицину 2019.

ЕПО је најтипичнији случај перцепције и одговора људског тела на хипоксију. Стога су Семенца и Ратклиф, два нобеловца, изабрали ЕПО као полазну тачку за проучавање механизма перцепције ћелије и адаптације на хипоксију. Први корак је био проналажење елемената ЕПО гена који би могли да реагују на промене кисеоника. Семенза је идентификовао кључну некодирајућу секвенцу од 256 база на 3' низводном крају гена који кодира ЕПО, названу елемент одговора на хипоксију. Ако је секвенца овог елемента мутирана или избрисана, способност ЕПО протеина да реагује на хипоксију је знатно смањена. Ако је ова секвенца елемената спојена са низводним 3' крајем других гена који нису повезани са хипоксијом, ови модификовани гени такође показују активацију сличну ЕПОу условима хипоксије.

Ратцлиффе и његов тим су затим открили да овај елемент хипоксичног одговора није присутан само у ћелијама бубрега или јетре одговорним за производњу ЕПО, већ и у многим другим типовима ћелија које могу функционисати у хипоксичним условима. Другим речима, овај одговор на хипоксију можда није специфичан за ЕПО, већ је распрострањенији феномен у ћелијама. Ове друге ћелије, које нису одговорне за производњу ЕПО, морају да садрже молекуле (као што су фактори транскрипције одговорни за укључивање експресије гена) који осећају промене у концентрацији кисеоника и везују се за елементе хипоксичног одговора да би укључили гене као што је ЕПО.