De tre vinnarna av 2019 års Nobelpris i fysiologi eller medicin, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza och Sir Peter J. Ratcliffe hade redan vunnit 2016 års Laskerpris i grundläggande medicin för sitt arbete med hur celler känner och anpassar sig till hypoxi, så det var inte särskilt förvånande. De upptäckte och identifierade nyckelmolekylen hypoxi-inducerbar faktor 1 (HIF-1). Idag vill vi gå tillbaka till ursprunget till studien, som är erytropoietin, eller EPO, en mirakelmolekyl.

Det är den viktigaste faktorn i produktionen av röda blodkroppar

Röda blodkroppar är den vanligaste typen av blodkroppar i blodet och är det huvudsakliga mediet för att transportera syre och koldioxid genom blodet hos ryggradsdjur. Erytrocyter genereras i benmärgen: Hematopoetiska stamceller prolifererar först och differentierar till stamceller till olika blodkroppar, och erytroida stamceller kan ytterligare differentiera och mogna till erytrocyter. Under normala förhållanden är human erytrocytproduktion mycket låg, men under stress som blödning, hemolys och hypoxi kan erytrocytproduktionen ökas med upp till åtta gånger. I denna process är erytropoietin EPO en av de viktigaste faktorerna.

EPO är ett hormon som syntetiseras huvudsakligen i njurarna. Dess kemiska natur är ett mycket glykosylerat protein. Varför i njurarna? Ungefär en liter blod rinner genom njurarna varje minut, så att de snabbt och effektivt kan upptäcka förändringar i syrehalten i blodet. När syrenivåerna i blodet är låga svarar njurarna snabbt och producerar stora mängder EPO. Den senare cirkulerar genom blodbanan till benmärgen, där den främjar omvandlingen av erytroida stamceller till röda blodkroppar. Mogna röda blodkroppar frigörs från benmärgen till cirkulationssystemet för att förbättra kroppens förmåga att binda till syre. När njurarna känner av en ökning av syre i blodet minskar de EPO-produktionen, vilket i sin tur minskar mängden röda blodkroppar i benmärgen.

Detta gör en perfekt justeringsslinga. Men människor som bor på hög höjd och vissa anemipatienter möter ofta tillståndet med kontinuerligt låg syrenivå i blodet, vilket inte kan fullborda ovanstående cirkulation och stimulera njurarna att kontinuerligt utsöndra EPO, så att blodets EPO-koncentration är högre än vanliga människor.

Det tog nästan 80 år att avslöja det

Liksom många stora upptäckter har forskarnas förståelse av EPO inte varit smidig, med frågor och utmaningar längs vägen. Det tog nästan 80 år från idén om EPO till den slutliga bestämningen av den specifika molekylen.

År 1906 injicerade de franska forskarna Carnot och Deflandre normala kaniner med serum från anemiska kaniner och fann att antalet röda blodkroppar i plasman hos normala kaniner ökade. De trodde att vissa humorala faktorer i plasman kunde stimulera och reglera produktionen av röda blodkroppar. Detta var den första EPO-konceptprototypen. Tyvärr har resultaten inte replikerats under efterföljande decennier, främst på grund av att antalet nya röda blodkroppar inte var korrekt.

Reissmann och Ruhenstroth-Bauers parabiosexperiment 1950 gav riktigt starka bevis. De kopplade kirurgiskt samman cirkulationssystemen hos två levande råttor, placerade en i en hypoxisk miljö och den andra andades normal luft. Som ett resultat producerade båda mössen enorma mängder röda blodkroppar. Det råder ingen tvekan om att det finns ett hormon i blodomloppet som stimulerar produktionen av röda blodkroppar, från vilket EPO fått sitt namn. Å andra sidan är EPO mycket känslig för hypoxi.

Vilken molekyl är EPO? Det tog den amerikanska forskaren Goldwasser 30 år att äntligen klargöra problemet på biokemisk nivå. Om en arbetare vill göra ett bra jobb måste han först slipa sina verktyg. EPO:s funktion är att stimulera nya röda blodkroppar, menräkningen av de senare är inte korrekt. Den viktigaste funktionella molekylen i röda blodkroppar är hemoglobininnehållande hem, som innehåller en järnjon i centrum. Så Goldwassers team märkte nyfödda röda blodkroppar med radioaktiva järnisotoper och utvecklade en känslig metod för att detektera EPO-aktivitet. Detta gör det möjligt att isolera och rena mycket låga koncentrationer av EPO (nanogram per milliliter) från djurvätskeprover. Men isoleringen av EPO var extremt svår. De bytte från njure till anemisk fårplasma, till urin från patienter med allvarlig järnbrist på grund av hakmaskinfektion, och slutligen, 1977, renade de 8 milligram humant EPO-protein från 2 550 liter urin från japanska patienter med aplastisk anemi.

1985 slutfördes proteinsekvenseringen och genkloningen av humant EPO. EPO-genen kodar för en polypeptid med 193 aminorester, som blir ett moget protein som består av 166 aminosyrarester efter att signalpeptiden klippts under utsöndring, och innehåller 4 platser för glykosyleringsmodifiering. 1998 analyserades NMR-lösningsstrukturen för EPO och kristallstrukturen för EPO och dess receptorkomplex. Vid denna tidpunkt har människor den mest intuitiva förståelsen av EPO.

Hittills har behandling för anemi vanligtvis krävt blodtransfusioner för att fylla på bristen på röda blodkroppar. När människor lär sig mer om EPO har injicering av det för att stimulera produktionen av röda blodkroppar i sin egen benmärg gjort problemet lättare. Men att rena EPO direkt från kroppsvätskor, som Goldwasser gjorde, är svårt och avkastningen är låg. Bestämningen av EPO-protein och gensekvens gjorde det möjligt att producera rekombinant humant EPO i stora mängder.

Det gjordes av ett bioteknikföretag som heter Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen grundades 1980 med bara sju medlemmar, i hopp om att göra bioläkemedel med de då framväxande teknikerna inom molekylärbiologi. Interferon, tillväxthormonfrisättande faktor, hepatit B-vaccin, epidermal tillväxtfaktor var bland de heta namnen på deras lista över mål, men inget av dessa försök lyckades. Fram till 1985 klonade Lin Fukun, en kinesisk vetenskapsman från Taiwan, Kina, genen från mänskligt EPO och insåg sedan produktionen av syntetiskt EPO med hjälp av DNA-rekombinationsteknologi.

Rekombinant humant EPO har samma sekvens som endogent EPO-protein och har också liknande glykosyleringsmodifiering. Naturligtvis har rekombinant humant EPO också aktiviteten av endogent EPO. I juni 1989 godkändes Amgens första produkt, rekombinant humant erytropoietin Epogen, av US FDA för behandling av anemi orsakad av kronisk njursvikt och anemi vid behandling av HIV-infektion. Epogens försäljning toppade 16 miljoner dollar på bara tre månader. Under de kommande två decennierna dominerade Amgen marknaden för återmonterad mänsklig EPO. Epogen gav Amgen 2,5 miljarder dollar i intäkter bara under 2010. Under 2018 var Amgens börsvärde 128,8 miljarder dollar, vilket gör det till det åttonde största läkemedelsföretaget i världen.

Det är värt att notera att Amgen initialt arbetade med Goldwasser för att tillhandahålla renade humana EPO-proteiner för sekvensering, men Goldwasser och Amgen föll snart ut på grund av ideologiska skillnader. Goldwasser och hans University of Chicago, som gjorde grundforskning, tänkte aldrig patentera det hormon han upptäckte, och har därför inte fått ett öre för EPO:s enorma kommersiella framgång.

Det -- hur är det ett stimulerande

När vi andas kommer syre in i cellernas mitokondrier för att driva andningskedjan och producera enorma mängder ATP, den huvudsakliga energikällan i våra kroppar. Anemiska människor har inte tillräckligt med friska röda blodkroppar, och den mest omedelbara effekten är att de inte får i sig tillräckligt med syre, vilket gör att de känner sig trötta, liknande andningsproblem under lång tid. När de injiceras med rekombinant humant EPO producerar anemipatienters kroppar fler röda blodkroppar,bära mer syre och producera mer av energimolekylen ATP, vilket effektivt lindrar symtomen.

Men vissa idrottsarbetare har också börjat tänka på rekombinant humant EPO. Om det artificiella rekombinanta hormonet av EPO-typ används för att stimulera idrottarnas kropp att producera fler röda blodkroppar, är det möjligt att förbättra idrottarnas förmåga att få syre och producera energimolekyler, vilket också kan förbättra idrottarnas prestation i uthållighet evenemang som cykling, långdistanslöpning och längdskidåkning. En artikel från 1980 i Journal of Applied Physiology visade att blodstimulerande medel (erytropoietin, artificiella syrebärare och blodtransfusioner) kan öka uthålligheten med 34 procent. Om idrottare använder EPO kan de springa 8 kilometer på löpbandet på 44 sekunder kortare tid än tidigare. Faktum är att cykling och maraton har varit de värsta förbrytarna för EPO-stimulantia. Under Tour de France 1998 arresterades en spansk lagläkare för Festina-laget vid den franska gränsen med 400 flaskor artificiell rekombinant EPO! Resultatet blev förstås att hela laget sparkades ut ur Touren och förbjöds.

Internationella olympiska kommittén lade till EPO på sin förbjudna lista vid Barcelona-spelen 1992, men att omorganisera mänskliga EPO-tester var så svårt att det före 2000-spelen inte fanns något sätt att effektivt upptäcka om idrottare använde det. Det finns flera anledningar: 1) EPO-halten i kroppsvätskor är mycket låg, och EPO per ml blod hos normala människor är cirka 130-230 nanogram; 2) Aminosyrasammansättningen för artificiellt rekombinant EPO är exakt densamma som hos humant endogent EPO-protein, endast formen av glykosylering är mycket lite annorlunda; 3) Halveringstiden för EPO i blodet är endast 5-6 timmar, och den är i allmänhet odetekterbar 4-7 dagar efter den sista injektionen; 4) Den individuella EPO-nivån är mycket olika, så det är svårt att fastställa en absolut kvantitativ standard.

Sedan 2000 har WADA använt urintester som den enda vetenskapliga verifieringsmetoden för direkt detektering av rekombinant EPO. På grund av de små skillnaderna mellan den glykoylerade formen av den artificiella rekombinanta EPO och den hos den mänskliga EPO, är de laddade egenskaperna hos de två molekylerna mycket små och kan särskiljas med en elektroforesmetod som kallas isoelektrisk fokusering, vilket är huvudstrategin för direkt detektion av det artificiella rekombinanta EPO. Vissa rekombinanta EPO uttryckt av celler härrörande från människa visade dock ingen skillnad i glykosylering, så vissa experter föreslog att exogent EPO och endogent EPO borde särskiljas genom olika kolisotopinnehåll.

Faktum är att det fortfarande finns begränsningar i olika testmetoder för EPO. Till exempel erkände Lance Armstrong, den amerikanske cykellegenden, att han tagit EPO och andra stimulantia under sina sju Tour de France-segrar, men han var faktiskt inte bekräftad positiv för EPO i något dopingtest vid den tiden. Vi måste fortfarande vänta och se om det är "en fot högre" eller "en fot högre".

Hur blir det till ett Nobelpris

Ett sista ord om kopplingen mellan EPO och 2019 års Nobelpris i fysiologi eller medicin.

EPO är det mest typiska fallet av mänsklig kropps uppfattning och svar på hypoxi. Därför valde Semenza och Ratcliffe, två nobelpristagare, EPO som utgångspunkt för att studera mekanismen för celluppfattning och anpassning till hypoxi. Det första steget var att hitta de element i EPO-genen som kunde svara på syreförändringar. Semenza identifierade en icke-kodande nyckelsekvens på 256 baser vid 3 'nedströmsänden av genen som kodar för EPO, kallad hypoxiresponselementet. Om denna elementsekvens muteras eller raderas, reduceras EPO-proteinets förmåga att svara på hypoxi kraftigt. Om denna elementsekvens fusioneras till nedströms 3'-änden av andra gener som inte är associerade med hypoxi, visar dessa modifierade gener också EPO-liknande aktiveringunder hypoxitillstånd.

Ratcliffe och hans team upptäckte sedan att detta hypoxiska svarselement inte bara finns i njur- eller levercellerna som är ansvariga för produktionen av EPO, utan även i många andra celltyper som kan fungera under hypoxiska förhållanden. Med andra ord kan detta svar på hypoxi inte vara specifikt för EPO, utan snarare ett mer utbrett fenomen i celler. Dessa andra celler, som inte är ansvariga för EPO-produktion, måste innehålla molekyler (som transkriptionsfaktorer som är ansvariga för att aktivera genuttryck) som känner av förändringar i syrekoncentration och binder till hypoxiska svarselement för att aktivera gener som EPO.