Ang tatlong nagwagi ng 2019 Nobel Prize sa Physiology o Medicine, sina William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza at Sir Peter J. Ratcliffe ay nanalo na ng 2016 Lasker Prize sa Basic Medicine para sa kanilang trabaho sa kung paano nararamdaman at nakaka-adapt ang mga cell. sa hypoxia, kaya hindi ito nakakagulat. Natuklasan at natukoy nila ang pangunahing molekula na hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1). Ngayon gusto nating bumalik sa pinagmulan ng pag-aaral, na erythropoietin, o EPO, isang molekula ng himala.

Ito ang pinakamahalagang salik sa paggawa ng pulang selula ng dugo

Ang mga pulang selula ng dugo ay ang pinaka-masaganang uri ng mga selula ng dugo sa dugo, at ang pangunahing daluyan para sa pagdadala ng oxygen at carbon dioxide sa pamamagitan ng dugo ng mga vertebrates. Nabubuo ang mga erythrocyte sa bone marrow: Ang mga hematopoietic stem cell ay unang dumami at nag-iba sa mga ninuno ng iba't ibang mga selula ng dugo, at ang mga erythroid progenitor ay maaaring higit pang mag-iba at maging erythrocytes. Sa normal na kondisyon, ang rate ng produksyon ng erythrocyte ng tao ay napakababa, ngunit sa ilalim ng stress tulad ng pagdurugo, hemolysis, at hypoxia, ang rate ng produksyon ng erythrocyte ay maaaring tumaas ng hanggang walong beses. Sa prosesong ito, ang erythropoietin EPO ay isa sa pinakamahalagang salik.

Ang EPO ay isang hormone na na-synthesize pangunahin sa bato. Ang kemikal na kalikasan nito ay isang mataas na glycosylated na protina. Bakit sa bato? Humigit-kumulang isang litro ng dugo ang dumadaloy sa mga bato bawat minuto, upang mabilis at mahusay nilang matukoy ang mga pagbabago sa antas ng oxygen sa dugo. Kapag mababa ang antas ng oxygen sa dugo, mabilis na tumutugon ang mga bato at gumagawa ng malalaking halaga ng EPO. Ang huli ay umiikot sa daloy ng dugo patungo sa bone marrow, kung saan itinataguyod nito ang pagbabago ng erythroid progenitor cells sa mga pulang selula ng dugo. Ang mga mature na pulang selula ng dugo ay inilalabas mula sa bone marrow papunta sa circulatory system upang mapabuti ang kakayahan ng katawan na magbigkis sa oxygen. Kapag naramdaman ng mga bato ang pagtaas ng oxygen sa dugo, binabawasan nila ang produksyon ng EPO, na binabawasan naman ang dami ng mga pulang selula ng dugo sa bone marrow.

Ito ay gumagawa ng isang perpektong adjustment loop. Gayunpaman, ang mga taong naninirahan sa mataas na altitude at ilang mga pasyente ng anemia ay kadalasang nakatagpo ng kondisyon ng patuloy na mababang antas ng oxygen sa dugo, na hindi makumpleto ang sirkulasyon sa itaas at pasiglahin ang bato na patuloy na mag-secrete ng EPO, upang ang konsentrasyon ng EPO sa dugo ay mas mataas kaysa sa mga ordinaryong tao.

Tumagal ng halos 80 taon upang matuklasan ito

Tulad ng maraming pangunahing pagtuklas, hindi naging maayos ang pag-unawa ng mga siyentipiko sa EPO, na may mga tanong at hamon sa daan. Kinailangan ito ng halos 80 taon mula sa konsepto ng EPO hanggang sa panghuling pagpapasiya ng partikular na molekula.

Noong 1906, ang mga siyentipikong Pranses na sina Carnot at Deflandre ay nag-inject ng mga normal na kuneho ng serum ng mga anemic na kuneho at nalaman na ang bilang ng pulang selula ng dugo sa plasma ng mga normal na kuneho ay tumaas. Naniniwala sila na ang ilang mga humoral na kadahilanan sa plasma ay maaaring pasiglahin at ayusin ang paggawa ng mga pulang selula ng dugo. Ito ang unang prototype ng konsepto ng EPO. Sa kasamaang palad, ang mga resulta ay hindi na-replicate sa mga susunod na dekada, higit sa lahat dahil ang bilang ng mga bagong pulang selula ng dugo ay hindi tumpak.

Ang eksperimentong parabiosis nina Reissmann at Ruhenstroth-Bauer noong 1950 ay nagbigay ng talagang matibay na ebidensya. Iniugnay nila sa operasyon ang mga sistema ng sirkulasyon ng dalawang buhay na daga, inilalagay ang isa sa isang hypoxic na kapaligiran at ang isa ay humihinga ng normal na hangin. Bilang resulta, ang parehong mga daga ay gumawa ng napakalaking halaga ng mga pulang selula ng dugo. Walang alinlangan na mayroong isang hormone sa daloy ng dugo na nagpapasigla sa paggawa ng mga pulang selula ng dugo, kung saan nakuha ng EPO ang pangalan nito. Sa kabilang banda, ang EPO ay napaka-sensitibo sa hypoxia.

Anong molekula ang EPO? Kinailangan ng Amerikanong siyentipiko na si Goldwasser ng 30 taon upang tuluyang linawin ang problema sa antas ng biochemical. Kung nais ng isang manggagawa na gumawa ng isang mahusay na trabaho, kailangan muna niyang patalasin ang kanyang mga kagamitan. Ang function ng EPO ay upang pasiglahin ang mga bagong pulang selula ng dugo, ngunithindi tumpak ang bilang ng huli. Ang pinakamahalagang functional molecule sa mga pulang selula ng dugo ay hemoglobin na naglalaman ng heme, na naglalaman ng ferrous ion sa gitna nito. Kaya nilagyan ng label ng koponan ng Goldwasser ang mga bagong panganak na pulang selula ng dugo ng radioactive iron isotopes at bumuo ng isang sensitibong paraan para sa pag-detect ng aktibidad ng EPO. Ginagawa nitong posible na ihiwalay at linisin ang napakababang konsentrasyon ng EPO (nanograms per milliliter) mula sa mga sample ng likido ng hayop. Ngunit ang paghihiwalay ng EPO ay lubhang mahirap. Lumipat sila mula sa kidney patungo sa anemic na plasma ng tupa, sa ihi ng mga pasyenteng may matinding kakulangan sa iron dahil sa impeksyon sa hookworm, at sa wakas, noong 1977, nilinis nila ang 8 milligrams ng human EPO protein mula sa 2,550 liters ng ihi mula sa mga Japanese na pasyente na may aplastic anemia.

Noong 1985, natapos ang pagkakasunud-sunod ng protina at pag-clone ng gene ng EPO ng tao. Ang EPO gene ay nag-e-encode ng polypeptide na may 193 amino residues, na nagiging isang mature na protina na binubuo ng 166 amino acid residues pagkatapos ma-clip ang signal peptide sa panahon ng pagtatago, at naglalaman ng 4 na site para sa pagbabago ng glycosylation. Noong 1998, nasuri ang istraktura ng solusyon ng NMR ng EPO at ang kristal na istraktura ng EPO at ang receptor complex nito. Sa puntong ito, ang mga tao ang may pinaka-intuitive na pag-unawa sa EPO.

Hanggang ngayon, ang paggamot para sa anemia ay karaniwang nangangailangan ng pagsasalin ng dugo upang mapunan ang kakulangan ng mga pulang selula ng dugo. Habang natututo ang mga tao ng higit pa tungkol sa EPO, ang pag-iniksyon nito upang pasiglahin ang produksyon ng pulang selula ng dugo sa kanilang sariling bone marrow ay nagpadali sa problema. Ngunit ang paglilinis ng EPO nang direkta mula sa mga likido sa katawan, tulad ng ginawa ni Goldwasser, ay mahirap at mababa ang ani. Ang pagpapasiya ng protina ng EPO at pagkakasunud-sunod ng gene ay naging posible upang makagawa ng recombinant na EPO ng tao sa maraming dami.

Ginawa ito ng isang kumpanya ng biotechnology na tinatawag na Applied Molecular Genetics (Amgen). Ang Amgen ay itinatag noong 1980 na may pitong miyembro lamang, umaasa na makagawa ng mga biopharmaceutical gamit ang mga umuusbong na pamamaraan ng molecular biology. Interferon, growth hormone releasing factor, hepatitis B vaccine, epidermal growth factor ay kabilang sa mga mainit na pangalan sa kanilang listahan ng mga target, ngunit wala sa mga pagtatangkang ito ang nagtagumpay. Hanggang 1985, si Lin Fukun, isang Chinese scientist mula sa Taiwan, China, ay nag-clone ng gene ng human EPO, at pagkatapos ay natanto ang paggawa ng synthetic EPO gamit ang DNA recombination technology.

Ang recombinant human EPO ay may parehong pagkakasunud-sunod ng endogenous EPO protein, at mayroon ding katulad na pagbabago sa glycosylation. Naturally, ang recombinant human EPO ay mayroon ding aktibidad ng endogenous EPO. Noong Hunyo 1989, ang unang produkto ng Amgen, ang recombinant na human erythropoietin Epogen, ay inaprubahan ng US FDA para sa paggamot ng anemia na dulot ng talamak na pagkabigo sa bato at anemia sa paggamot ng impeksyon sa HIV. Ang mga benta ng Epogen ay nanguna sa $16 milyon sa loob lamang ng tatlong buwan. Sa susunod na dalawang dekada, pinamunuan ni Amgen ang merkado para sa muling pinagsama-samang EPO ng tao. Dinala ni Epogen si Amgen ng $2.5 bilyon sa kita noong 2010 lamang. Noong 2018, ang halaga ng stock market ng Amgen ay $128.8 bilyon, na ginagawa itong ikawalong pinakamalaking kumpanya ng parmasyutiko sa mundo.

Kapansin-pansin na una nang nakipagtulungan si Amgen sa Goldwasser upang magbigay ng purified human EPO proteins para sa sequencing, ngunit hindi nagtagal ay nahulog ang Goldwasser at Amgen dahil sa mga pagkakaiba sa ideolohiya. Ang Goldwasser at ang kanyang Unibersidad ng Chicago, na nagsagawa ng pangunahing pananaliksik, ay hindi kailanman naisip na patente ang hormone na kanyang natuklasan, at sa gayon ay hindi nakatanggap ng kahit isang sentimo para sa malaking tagumpay sa komersyo ng EPO.

Ito -- paano ito isang stimulant

Kapag huminga tayo, pumapasok ang oxygen sa mitochondria ng mga selula upang himukin ang respiratory chain at gumawa ng napakalaking halaga ng ATP, ang pangunahing pinagkukunan ng enerhiya sa ating mga katawan. Ang mga taong may anemic ay walang sapat na malusog na pulang selula ng dugo, at ang pinaka-kaagad na epekto ay hindi sila kumukuha ng sapat na oxygen, na nagpaparamdam sa kanila ng pagod, katulad ng mga problema sa paghinga sa mahabang panahon. Kapag na-injected ng recombinant na EPO ng tao, ang katawan ng mga pasyente ng anemia ay gumagawa ng mas maraming pulang selula ng dugo,nagdadala ng mas maraming oxygen, at gumagawa ng mas maraming molekula ng enerhiya na ATP, na epektibong nagpapagaan ng mga sintomas.

Gayunpaman, ang ilang mga manggagawa sa palakasan ay nagsimula na ring mag-isip ng recombinant human EPO. Kung ang artificial recombinant hormone ng uri ng EPO ay ginagamit upang pasiglahin ang katawan ng mga atleta na gumawa ng mas maraming pulang selula ng dugo, posible na mapabuti ang kakayahan ng mga atleta na makakuha ng oxygen at makagawa ng mga molekula ng enerhiya, na maaari ring mapabuti ang pagganap ng mga atleta sa pagtitiis mga kaganapan tulad ng pagbibisikleta, long-distance running at cross-country skiing. Ang isang 1980 na papel sa Journal of Applied Physiology ay nagpakita na ang mga stimulant ng dugo (erythropoietin, artificial oxygen carriers at blood transfusions) ay maaaring magpataas ng tibay ng 34 porsiyento. Kung gagamitin ng mga atleta ang EPO, maaari silang tumakbo ng 8 kilometro sa treadmill sa loob ng 44 segundong mas kaunting oras kaysa dati. Sa katunayan, ang pagbibisikleta at mga marathon ay ang pinakamasamang nagkasala para sa mga stimulant ng EPO. Noong 1998 Tour de France, isang Spanish team doctor para sa Festina team ang inaresto sa French border na may 400 bote ng artificial recombinant EPO! Ang resulta, siyempre, ay ang buong koponan ay pinaalis sa Tour at pinagbawalan.

Idinagdag ng International Olympic Committee ang EPO sa ipinagbabawal nitong listahan sa 1992 Barcelona Games, ngunit napakahirap na muling ayusin ang human EPO testing na bago ang 2000 Games ay walang paraan upang epektibong matukoy kung ginagamit ito ng mga atleta. Mayroong ilang mga kadahilanan: 1) Ang nilalaman ng EPO sa mga likido sa katawan ay napakababa, at ang EPO bawat ml ng dugo sa mga normal na tao ay humigit-kumulang 130-230 nanograms; 2) Ang komposisyon ng amino acid ng artipisyal na recombinant na EPO ay eksaktong kapareho ng sa endogenous na protina ng EPO ng tao, tanging ang anyo ng glycosylation ay bahagyang naiiba; 3) Ang kalahating buhay ng EPO sa dugo ay 5-6 na oras lamang, at sa pangkalahatan ay hindi ito matukoy 4-7 araw pagkatapos ng huling iniksyon; 4) Ang indibidwal na antas ng EPO ay ibang-iba, kaya mahirap magtatag ng ganap na pamantayang dami.

Mula noong 2000, ginamit ng WADA ang pagsusuri sa ihi bilang ang tanging siyentipikong paraan ng pagpapatunay para sa direktang pagtuklas ng recombinant na EPO. Dahil sa bahagyang pagkakaiba sa pagitan ng glycoylated form ng artipisyal na recombinant EPO at ng EPO ng tao, ang mga sisingilin na katangian ng dalawang molekula ay napakaliit at maaaring makilala sa pamamagitan ng paraan ng electrophoresis na tinatawag na isoelectric focusing, na siyang pangunahing diskarte para sa direktang pagtuklas ng artipisyal na recombinant na EPO. Gayunpaman, ang ilang recombinant na EPO na ipinahayag ng mga human derived cell ay hindi nagpakita ng pagkakaiba sa glycosylation, kaya iminungkahi ng ilang eksperto na ang exogenous EPO at endogenous EPO ay dapat na makilala sa pamamagitan ng iba't ibang nilalaman ng carbon isotope.

Sa katunayan, may mga limitasyon pa rin sa iba't ibang paraan ng pagsubok para sa EPO. Halimbawa, si Lance Armstrong, ang American cycling legend, ay umamin na kumuha ng EPO at iba pang mga stimulant sa panahon ng kanyang pitong tagumpay sa Tour de France, ngunit hindi siya aktwal na nakumpirmang positibo para sa EPO sa anumang doping test noong panahong iyon. Kailangan pa nating maghintay at tingnan kung ito ay "one foot higher" o "one foot higher".

Paano ito nakakakuha ng Nobel Prize

Isang huling salita tungkol sa koneksyon sa pagitan ng EPO at ng 2019 Nobel Prize sa Physiology o Medicine.

Ang EPO ay ang pinakakaraniwang kaso ng pang-unawa ng katawan ng tao at pagtugon sa hypoxia. Samakatuwid, pinili ni Semenza at Ratcliffe, dalawang Nobel laureates, ang EPO bilang panimulang punto upang pag-aralan ang mekanismo ng cell perception at adaptasyon sa hypoxia. Ang unang hakbang ay upang mahanap ang mga elemento ng EPO gene na maaaring tumugon sa mga pagbabago sa oxygen. Tinukoy ni Semenza ang isang pangunahing 256-base na non-coding sequence sa 3 'downstream na dulo ng gene encoding EPO, na pinangalanan ang hypoxia response element. Kung ang pagkakasunud-sunod ng elementong ito ay na-mutate o natanggal, ang kakayahan ng protina ng EPO na tumugon sa hypoxia ay lubhang nababawasan. Kung ang pagkakasunud-sunod ng elementong ito ay pinagsama sa ibabang bahagi ng 3 'endo ng iba pang mga gene na hindi nauugnay sa hypoxia, ang mga binagong gene na ito ay nagpapakita rin ng EPO-like activation.sa ilalim ng mga kondisyon ng hypoxia.

Natuklasan ni Ratcliffe at ng kanyang koponan na ang hypoxic response element na ito ay hindi lamang naroroon sa kidney o liver cells na responsable sa paggawa ng EPO, kundi pati na rin sa maraming iba pang uri ng cell na maaaring gumana sa ilalim ng hypoxic na kondisyon. Sa madaling salita, ang tugon na ito sa hypoxia ay maaaring hindi tiyak sa EPO, ngunit sa halip ay isang mas malawak na kababalaghan sa mga cell. Ang iba pang mga cell na ito, na hindi responsable para sa produksyon ng EPO, ay dapat maglaman ng mga molekula (gaya ng mga salik ng transkripsyon na responsable sa pag-on ng expression ng gene) na nakakaramdam ng mga pagbabago sa konsentrasyon ng oxygen at nagbubuklod sa mga hypoxic na elemento ng pagtugon upang i-on ang mga gene gaya ng EPO.