2019 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nü kazanan üç kişi, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza ve Sir Peter J. Ratcliffe, hücrelerin nasıl algıladığı ve uyum sağladığı konusundaki çalışmaları nedeniyle 2016 Lasker Temel Tıp Ödülü'nü kazanmıştı. hipoksiye, bu yüzden özellikle şaşırtıcı değildi. Anahtar molekül hipoksi ile indüklenebilir faktör 1'i (HIF-1) keşfettiler ve tanımladılar. Bugün çalışmanın kaynağı olan eritropoietin veya mucize bir molekül olan EPO'ya geri dönmek istiyoruz.

Kırmızı kan hücresi üretimindeki en önemli faktördür.

Kırmızı kan hücreleri, kanda en çok bulunan kan hücresi türüdür ve omurgalıların kanında oksijen ve karbondioksitin taşınması için ana ortamdır. Eritrositler kemik iliğinde üretilir: Hematopoietik kök hücreler önce çoğalır ve çeşitli kan hücrelerinin progenitörlerine farklılaşır ve eritroid progenitörleri daha sonra farklılaşabilir ve eritrositlere dönüşebilir. Normal şartlar altında insan eritrosit üretim hızı çok düşüktür, ancak kanama, hemoliz ve hipoksi gibi stres altında eritrosit üretim hızı sekiz kata kadar artabilir. Bu süreçte eritropoietin EPO en önemli faktörlerden biridir.

EPO, esas olarak böbrekte sentezlenen bir hormondur. Kimyasal yapısı yüksek oranda glikosile edilmiş bir proteindir. Neden böbreklerde? Böbreklerden her dakika yaklaşık bir litre kan akar, böylece kandaki oksijen seviyelerindeki değişiklikleri hızlı ve verimli bir şekilde tespit edebilirler. Kandaki oksijen seviyeleri düşük olduğunda, böbrekler hızla yanıt verir ve büyük miktarlarda EPO üretir. İkincisi, kan dolaşımı yoluyla eritroid progenitör hücrelerin kırmızı kan hücrelerine dönüşümünü teşvik ettiği kemik iliğine dolaşır. Olgun kırmızı kan hücreleri, vücudun oksijene bağlanma yeteneğini geliştirmek için kemik iliğinden dolaşım sistemine salınır. Böbrekler kandaki oksijende bir artış algıladıklarında, EPO üretimini azaltırlar ve bu da kemik iliğindeki kırmızı kan hücrelerinin miktarını azaltır.

Bu mükemmel bir ayar döngüsü oluşturur. Bununla birlikte, yüksek irtifada yaşayan insanlar ve bazı anemi hastaları sıklıkla, yukarıdaki dolaşımı tamamlayamayan ve böbreği sürekli olarak EPO salgılaması için uyaran sürekli düşük kan oksijen seviyesi durumuyla karşılaşır, böylece kan EPO konsantrasyonu sıradan insanlardan daha yüksektir.

Onu ortaya çıkarmak yaklaşık 80 yıl sürdü

Pek çok büyük keşif gibi, bilim insanlarının EPO'yu anlamaları da, yol boyunca sorular ve zorluklarla sorunsuz bir seyir izlemedi. EPO kavramından spesifik molekülün nihai olarak belirlenmesine kadar yaklaşık 80 yıl geçti.

1906'da Fransız bilim adamları Carnot ve Deflandre, normal tavşanlara anemik tavşanların serumunu enjekte ettiler ve normal tavşanların plazmasındaki alyuvar sayısının arttığını buldular. Plazmadaki bazı hümoral faktörlerin kırmızı kan hücrelerinin üretimini uyarabileceğine ve düzenleyebileceğine inanıyorlardı. Bu, ilk EPO konsept prototipiydi. Ne yazık ki, esas olarak yeni kırmızı kan hücrelerinin sayımının doğru olmaması nedeniyle sonuçlar sonraki yıllarda tekrarlanamadı.

Reissmann ve Ruhenstroth-Bauer'in 1950'deki parabiyoz deneyi gerçekten güçlü kanıtlar sağladı. İki canlı farenin dolaşım sistemlerini ameliyatla birbirine bağladılar, birini hipoksik bir ortama yerleştirdiler ve diğerini normal hava soludular. Sonuç olarak, her iki fare de büyük miktarlarda kırmızı kan hücresi üretti. Kan dolaşımında, EPO'nun adını aldığı kırmızı kan hücrelerinin üretimini uyaran bir hormon olduğuna şüphe yoktur. Öte yandan, EPO hipoksiye karşı çok hassastır.

EPO hangi moleküldür? Amerikalı bilim adamı Goldwasser'ın sorunu biyokimyasal düzeyde nihayet açıklığa kavuşturması 30 yılını aldı. Bir işçi iyi bir iş çıkarmak istiyorsa, önce aletlerini bilemelidir. EPO'nun işlevi yeni kırmızı kan hücrelerini uyarmaktır, ancakikincisinin sayısı doğru değil. Kırmızı kan hücrelerindeki en önemli fonksiyonel molekül, merkezinde bir demir iyonu içeren hemoglobin içeren hemdir. Goldwasser'ın ekibi, yeni doğan kırmızı kan hücrelerini radyoaktif demir izotoplarıyla etiketledi ve EPO aktivitesini saptamak için hassas bir yöntem geliştirdi. Bu, hayvan sıvı örneklerinden çok düşük konsantrasyonlarda EPO'nun (mililitre başına nanogram) izole edilmesini ve saflaştırılmasını mümkün kılar. Ancak EPO'nun izolasyonu son derece zordu. Böbrekten anemik koyun plazmasına, kancalı kurt enfeksiyonu nedeniyle ciddi demir eksikliği olan hastaların idrarına geçtiler ve son olarak, 1977'de, aplastik anemisi olan Japon hastalardan alınan 2.550 litre idrardan 8 miligram insan EPO proteinini saflaştırdılar.

1985 yılında, insan EPO'sunun protein dizilimi ve gen klonlaması tamamlandı. EPO geni, sekresyon sırasında sinyal peptidi kırpıldıktan sonra 166 amino asit kalıntısından oluşan olgun bir protein haline gelen ve glikosilasyon modifikasyonu için 4 bölge içeren 193 amino kalıntılı bir polipeptidi kodlar. 1998'de EPO'nun NMR çözelti yapısı ve EPO'nun kristal yapısı ve reseptör kompleksi analiz edildi. Bu noktada, insanlar EPO'nun en sezgisel anlayışına sahiptir.

Şimdiye kadar, anemi tedavisi genellikle kırmızı kan hücrelerinin eksikliğini gidermek için kan nakli gerektiriyordu. İnsanlar EPO hakkında daha fazla şey öğrendikçe, kendi kemik iliğinde kırmızı kan hücresi üretimini uyarmak için enjekte etmek sorunu kolaylaştırdı. Ancak Goldwasser'ın yaptığı gibi EPO'yu doğrudan vücut sıvılarından arındırmak zordur ve verim düşüktür. EPO proteininin ve gen dizisinin belirlenmesi, büyük miktarlarda rekombinant insan EPO'su üretilmesini mümkün kıldı.

Applied Molecular Genetics (Amgen) adlı bir biyoteknoloji şirketi tarafından yapıldı. Amgen, 1980 yılında, o zamanlar ortaya çıkan moleküler biyoloji teknikleriyle biyofarmasötikler yapma umuduyla sadece yedi üye ile kuruldu. İnterferon, büyüme hormonu salgılatıcı faktör, hepatit B aşısı, epidermal büyüme faktörü hedef listelerinde öne çıkan isimler arasındaydı ancak bu girişimlerin hiçbiri başarılı olamadı. 1985 yılına kadar Tayvan, Çin'den Çinli bir bilim adamı olan Lin Fukun, insan EPO'sunun genini klonladı ve ardından DNA rekombinasyon teknolojisini kullanarak sentetik EPO üretimini gerçekleştirdi.

Rekombinant insan EPO'su, endojen EPO proteini ile aynı sekansa sahiptir ve ayrıca benzer glikosilasyon modifikasyonuna sahiptir. Doğal olarak, rekombinant insan EPO'su da endojen EPO aktivitesine sahiptir. Haziran 1989'da, Amgen'in ilk ürünü olan rekombinant insan eritropoietin Epogen, kronik böbrek yetmezliğinin neden olduğu anemi ve HIV enfeksiyonunun tedavisinde anemi tedavisi için ABD FDA tarafından onaylandı. Epogen satışları sadece üç ayda 16 milyon doları aştı. Sonraki yirmi yılda Amgen, yeniden birleştirilmiş insan EPO pazarına hakim oldu. Epogen, Amgen'e yalnızca 2010 yılında 2,5 milyar dolar gelir getirdi. 2018'de Amgen'in borsa değeri 128,8 milyar dolardı ve bu da onu dünyanın en büyük sekizinci ilaç şirketi yapıyor.

Amgen'in başlangıçta sıralama için saflaştırılmış insan EPO proteinleri sağlamak üzere Goldwasser ile birlikte çalıştığını, ancak Goldwasser ve Amgen'in ideolojik farklılıklar nedeniyle kısa süre sonra düştüğünü belirtmekte fayda var. Goldwasser ve temel araştırmalar yapan Chicago Üniversitesi, keşfettiği hormonun patentini almayı asla düşünmedi ve bu nedenle EPO'nun devasa ticari başarısı için bir kuruş bile almadı.

O -- nasıl bir uyarıcı

Nefes aldığımızda oksijen, solunum zincirini yürütmek ve vücudumuzdaki ana enerji kaynağı olan büyük miktarlarda ATP üretmek için hücrelerin mitokondrilerine girer. Anemik insanlar yeterince sağlıklı kırmızı kan hücrelerine sahip değildir ve en acil etkisi, yeterince oksijen almamasıdır, bu da uzun vadede nefes alma problemlerine benzer şekilde kendilerini yorgun hissetmelerine neden olur. Rekombinant insan EPO'su enjekte edildiğinde, anemi hastalarının vücutları daha fazla kırmızı kan hücresi üretir.daha fazla oksijen taşır ve daha fazla enerji molekülü ATP üreterek semptomları etkili bir şekilde giderir.

Bununla birlikte, bazı spor çalışanları da rekombinant insan EPO'sunu düşünmeye başladılar. Sporcuların vücudunu daha fazla kırmızı kan hücresi üretmesi için uyarmak için EPO tipi yapay rekombinant hormon kullanılırsa, sporcuların oksijen elde etme ve enerji molekülleri üretme yeteneklerini geliştirmek mümkündür, bu da sporcuların dayanıklılık performansını artırabilir. bisiklet, uzun mesafe koşusu ve kros kayağı gibi etkinlikler. Journal of Applied Physiology'de 1980'de yayınlanan bir makale, kan uyarıcılarının (eritropoietin, yapay oksijen taşıyıcıları ve kan transfüzyonları) dayanıklılığı yüzde 34 artırabildiğini gösterdi. Sporcular EPO'yu kullanırsa, koşu bandında 8 kilometreyi eskisinden 44 saniye daha kısa sürede koşabilirler. Aslında, bisiklet ve maratonlar, EPO uyarıcıları için en kötü suçlular olmuştur. 1998 Tour de France sırasında, Festina takımı için bir İspanyol takım doktoru, 400 şişe yapay rekombinant EPO ile Fransa sınırında tutuklandı! Sonuç, elbette, tüm takımın Tur'dan atılması ve yasaklanmasıydı.

Uluslararası Olimpiyat Komitesi, 1992 Barselona Oyunlarında EPO'yu yasaklı listesine ekledi, ancak insan EPO testini yeniden düzenlemek o kadar zordu ki, 2000 Oyunlarından önce sporcuların bunu kullanıp kullanmadığını etkili bir şekilde tespit etmenin bir yolu yoktu. Bunun birkaç nedeni vardır: 1) Vücut sıvılarındaki EPO içeriği çok düşüktür ve normal insanlarda kanın ml'si başına EPO yaklaşık 130-230 nanogramdır; 2) Yapay rekombinant EPO'nun amino asit bileşimi, insan endojen EPO proteinininkiyle tamamen aynıdır, sadece glikosilasyon biçimi çok az farklıdır; 3) EPO'nun kandaki yarı ömrü sadece 5-6 saattir ve genellikle son enjeksiyondan 4-7 gün sonra saptanamaz; 4) Bireysel EPO seviyesi çok farklıdır, bu nedenle mutlak bir kantitatif standart oluşturmak zordur.

2000 yılından bu yana WADA, rekombinant EPO'nun doğrudan tespiti için tek bilimsel doğrulama yöntemi olarak idrar testini kullanmaktadır. Yapay rekombinant EPO'nun glikolize formu ile insan EPO'sununki arasındaki küçük farklılıklar nedeniyle, iki molekülün yüklü özellikleri çok küçüktür ve ana strateji olan izoelektrik odaklama adı verilen bir elektroforez yöntemiyle ayırt edilebilir. yapay rekombinant EPO'nun doğrudan saptanması. Bununla birlikte, insandan türetilmiş hücreler tarafından eksprese edilen bazı rekombinant EPO, glikosilasyonda hiçbir fark göstermedi, bu nedenle bazı uzmanlar, eksojen EPO ve endojen EPO'nun farklı karbon izotop içeriği ile ayırt edilmesi gerektiğini öne sürdü.

Aslında, EPO için farklı test yöntemlerinde hala sınırlamalar vardır. Örneğin, Amerikan bisiklet efsanesi Lance Armstrong, yedi Tour de France zaferi sırasında EPO ve diğer uyarıcıları aldığını itiraf etti, ancak o sırada herhangi bir doping testinde EPO için pozitif olduğu doğrulanmadı. Hala "bir fit daha yüksek" mi yoksa "bir fit daha yüksek" mi olduğunu bekleyip görmemiz gerekiyor.

Nobel Ödülü nasıl olur?

EPO ile 2019 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü arasındaki bağlantı hakkında son bir söz.

EPO, insan vücudunun hipoksiye tepki ve algısının en tipik örneğidir. Bu nedenle, iki Nobel ödüllü Semenza ve Ratcliffe, hücre algısı ve hipoksiye adaptasyon mekanizmasını incelemek için başlangıç ​​noktası olarak EPO'yu seçtiler. İlk adım, EPO geninin oksijen değişikliklerine yanıt verebilecek elementlerini bulmaktı. Semenza, hipoksiya yanıt elemanı olarak adlandırılan EPO'yu kodlayan genin 3' aşağı akış ucunda 256-bazlı anahtar bir kodlamayan dizi tanımladı. Bu element dizisi mutasyona uğrarsa veya silinirse, EPO proteininin hipoksiye yanıt verme yeteneği büyük ölçüde azalır. Bu element sekansı, hipoksi ile ilişkili olmayan diğer genlerin aşağı akış 3' ucuna kaynaşırsa, bu modifiye edilmiş genler ayrıca EPO benzeri aktivasyon gösterir.hipoksi koşulları altında.

Ratcliffe ve ekibi daha sonra bu hipoksik yanıt öğesinin yalnızca EPO üretiminden sorumlu böbrek veya karaciğer hücrelerinde değil, aynı zamanda hipoksik koşullar altında işlev görebilen diğer birçok hücre tipinde de bulunduğunu keşfetti. Başka bir deyişle, hipoksiye verilen bu yanıt, EPO'ya özgü olmayabilir, hücrelerde daha yaygın bir fenomen olabilir. EPO üretiminden sorumlu olmayan bu diğer hücreler, oksijen konsantrasyonundaki değişiklikleri algılayan ve EPO gibi genleri açmak için hipoksik tepki elemanlarına bağlanan moleküller (gen ifadesini açmaktan sorumlu transkripsiyon faktörleri gibi) içermelidir.