Троє лауреатів Нобелівської премії з фізіології та медицини 2019 року Вільям Г. Кейлін-молодший, Грегг Л. Семенза та сер Пітер Дж. Реткліфф уже отримали премію Ласкера з основ медицини 2016 року за свою роботу над тим, як клітини сприймають і адаптуються. до гіпоксії, тому це не було особливо дивним. Вони виявили та ідентифікували ключову молекулу фактора 1, індукованого гіпоксією (HIF-1). Сьогодні ми хочемо повернутися до витоків дослідження, яким є еритропоетин, або EPO, диво-молекула.

Це найважливіший фактор у виробництві еритроцитів

Еритроцити є найпоширенішим типом кров’яних тілець у крові та є основним середовищем для транспортування кисню та вуглекислого газу через кров хребетних. Еритроцити утворюються в кістковому мозку: кровотворні стовбурові клітини спочатку проліферують і диференціюються в попередники різних клітин крові, а еритроїдні попередники можуть далі диференціюватися і дозрівати в еритроцити. У нормальних умовах швидкість виробництва еритроцитів у людини дуже низька, але під час стресу, такого як кровотеча, гемоліз і гіпоксія, швидкість виробництва еритроцитів може збільшуватися до восьми разів. У цьому процесі еритропоетин EPO є одним із найважливіших факторів.

ЕПО - це гормон, що синтезується в основному в нирках. Його хімічна природа є високоглікозильованим білком. Чому в нирках? Близько літра крові протікає через нирки щохвилини, тому вони можуть швидко й ефективно виявляти зміни рівня кисню в крові. Коли рівень кисню в крові низький, нирки швидко реагують і виробляють велику кількість EPO. Останній циркулює через кровотік до кісткового мозку, де сприяє перетворенню еритроїдних клітин-попередників на еритроцити. Зрілі еритроцити виділяються з кісткового мозку в кровоносну систему, щоб покращити здатність організму зв’язуватися з киснем. Коли нирки відчувають збільшення кисню в крові, вони зменшують виробництво EPO, що, у свою чергу, зменшує кількість еритроцитів у кістковому мозку.

Це створює ідеальну петлю регулювання. Однак люди, які живуть на великій висоті, і деякі пацієнти з анемією часто стикаються зі станом постійного низького рівня кисню в крові, який не може завершити описану вище циркуляцію та стимулювати нирки до безперервної секреції EPO, так що концентрація EPO в крові вища, ніж у звичайних людей.

Знадобилося майже 80 років, щоб його розкрити

Як і багато інших важливих відкриттів, розуміння вченими EPO не було гладким, виникали питання та проблеми. Від концепції EPO до остаточного визначення конкретної молекули минуло майже 80 років.

У 1906 році французькі вчені Карно і Дефландр ввели нормальним кроликам сироватку анемічних кроликів і виявили, що кількість еритроцитів у плазмі нормальних кроликів збільшилася. Вони вважали, що деякі гуморальні фактори в плазмі можуть стимулювати і регулювати вироблення еритроцитів. Це був перший концептуальний прототип EPO. На жаль, результати не були відтворені в наступні десятиліття, головним чином тому, що підрахунок нових еритроцитів був неточним.

Експеримент Рейсмана та Руенстрота-Бауера з парабіозом у 1950 році надав дійсно вагомі докази. Вони хірургічним шляхом з'єднали системи кровообігу двох живих щурів, помістивши одного в гіпоксичне середовище, а іншого дихаючи нормальним повітрям. В результаті обидві миші виробляли величезну кількість еритроцитів. Немає сумніву, що в крові є гормон, який стимулює вироблення червоних кров’яних тілець, від чого EPO отримав свою назву. З іншого боку, EPO дуже чутливий до гіпоксії.

Яка молекула є EPO? Американському вченому Голдвассеру знадобилося 30 років, щоб остаточно прояснити проблему на біохімічному рівні. Якщо робітник хоче добре виконувати роботу, він повинен спочатку наточити свої інструменти. Функція EPO полягає в стимулюванні нових еритроцитів, алепідрахунок останнього не є точним. Найважливішою функціональною молекулою в еритроцитах є гемоглобін, що містить гем, у центрі якого міститься іон двовалентного заліза. Тому команда Голдвассера позначила еритроцити новонароджених радіоактивними ізотопами заліза та розробила чутливий метод виявлення активності EPO. Це дає змогу виділяти та очищати дуже низькі концентрації EPO (нанограми на мілілітр) із зразків тваринної рідини. Але ізоляція EPO була надзвичайно важкою. Вони перейшли з ниркової плазми анемічної вівці на сечу пацієнтів із сильним дефіцитом заліза через інфекцію анкілостом, і, нарешті, у 1977 році очистили 8 міліграмів білка EPO людини з 2550 літрів сечі японських пацієнтів з апластичною анемією.

У 1985 році було завершено секвенування білка та клонування гена ЕПО людини. Ген EPO кодує поліпептид із 193 амінозалишками, який стає зрілим білком, що складається із 166 амінокислотних залишків після того, як сигнальний пептид відрізається під час секреції, і містить 4 сайти для модифікації глікозилювання. У 1998 році було проаналізовано ЯМР структуру розчину EPO та кристалічну структуру EPO та його рецепторного комплексу. На цьому етапі люди мають найбільш інтуїтивне розуміння EPO.

Досі лікування анемії зазвичай вимагало переливання крові для поповнення дефіциту еритроцитів. Коли люди дізнаються більше про EPO, його ін’єкції для стимуляції виробництва еритроцитів у власному кістковому мозку полегшують проблему. Але очистити EPO безпосередньо з рідин організму, як це зробив Голдвассер, складно, і результати низькі. Визначення білка EPO і послідовності гена дозволило отримати рекомбінантний EPO людини у великих кількостях.

Це було зроблено біотехнологічною компанією Applied Molecular Genetics (Amgen). Компанія Amgen була заснована в 1980 році лише із семи членів, сподіваючись виробляти біофармацевтичні препарати за допомогою методів молекулярної біології, що розвивалися на той час. Інтерферон, рилізинг-фактор гормону росту, вакцина проти гепатиту B, епідермальний фактор росту були серед гарячих імен у списку цілей, але жодна з цих спроб не увінчалася успіхом. До 1985 року Лінь Фукун, китайський вчений з Тайваню, Китай, клонував ген людського EPO, а потім реалізував виробництво синтетичного EPO за допомогою технології рекомбінації ДНК.

Рекомбінантний людський EPO має ту ж послідовність, що й ендогенний білок EPO, а також має подібну модифікацію глікозилювання. Природно, рекомбінантний людський EPO також має активність ендогенного EPO. У червні 1989 року перший продукт Amgen, рекомбінантний еритропоетин людини Epogen, був схвалений FDA США для лікування анемії, викликаної хронічною нирковою недостатністю, і анемії при лікуванні ВІЛ-інфекції. Продажі Epogen перевищили 16 мільйонів доларів лише за три місяці. Протягом наступних двох десятиліть Amgen домінувала на ринку повторно зібраних людських EPO. Тільки в 2010 році Epogen приніс Amgen 2,5 мільярда доларів доходу. У 2018 році вартість Amgen на фондовому ринку становила 128,8 мільярда доларів, що зробило її восьмою за величиною фармацевтичною компанією у світі.

Варто зазначити, що Amgen спочатку працював з Goldwasser, щоб забезпечити очищені людські білки EPO для секвенування, але Goldwasser і Amgen незабаром розійшлися через ідеологічні розбіжності. Голдвассер і його університет Чикаго, які проводили фундаментальні дослідження, ніколи не думали запатентувати відкритий ним гормон, тому не отримали жодного пенні за величезний комерційний успіх EPO.

Це -- як це стимулятор

Коли ми дихаємо, кисень потрапляє в мітохондрії клітин, щоб привести в дію дихальний ланцюг і виробити величезну кількість АТФ, основного джерела енергії в нашому тілі. Люди з анемією не мають достатньої кількості здорових червоних кров’яних тілець, і найбільш миттєвим ефектом є те, що вони не отримують достатньо кисню, через що вони відчувають втому, схожу на проблеми з диханням під час тривалої пробіжки. При введенні рекомбінантного людського EPO організм пацієнтів з анемією виробляє більше еритроцитів,переносять більше кисню та виробляють більше енергетичної молекули АТФ, ефективно полегшуючи симптоми.

Однак деякі спортивні працівники також почали думати про рекомбінантний людський EPO. Якщо штучний рекомбінантний гормон типу EPO використовується для стимуляції організму спортсменів виробляти більше еритроцитів, можна покращити здатність спортсменів отримувати кисень і виробляти молекули енергії, що також може покращити продуктивність спортсменів у витривалості. такі події, як велоспорт, біг на довгі дистанції та лижні гонки. Стаття 1980 року в Journal of Applied Physiology показала, що стимулятори крові (еритропоетин, штучні переносники кисню та переливання крові) можуть збільшити витривалість на 34 відсотки. Якщо спортсмени використовують EPO, вони можуть пробігти 8 кілометрів на біговій доріжці за 44 секунди менше часу, ніж раніше. Фактично, їзда на велосипеді та марафони були найгіршими порушниками стимуляторів EPO. Під час Тур де Франс 1998 року лікар іспанської команди Festina був заарештований на французькому кордоні з 400 пляшками штучного рекомбінантного EPO! Результатом, звичайно, стало те, що всю команду вигнали з Туру та забанили.

Міжнародний олімпійський комітет додав EPO до свого списку заборонених на Іграх у Барселоні 1992 року, але реорганізація тестування EPO на людях була настільки важкою, що до Ігор 2000 року не було жодного способу ефективно визначити, чи використовують його спортсмени. Існує кілька причин: 1) вміст ЕПО в рідинах організму дуже низький, а ЕПО на мл крові у нормальних людей становить близько 130-230 нанограмів; 2) Амінокислотний склад штучного рекомбінантного EPO точно такий же, як і ендогенного білка EPO людини, лише форма глікозилювання дуже незначно відрізняється; 3) Період напіврозпаду EPO в крові становить лише 5-6 годин, і його, як правило, не виявляють через 4-7 днів після останньої ін'єкції; 4) Індивідуальний рівень EPO дуже різний, тому важко встановити абсолютний кількісний стандарт.

З 2000 року WADA використовує аналіз сечі як єдиний науковий метод перевірки прямого виявлення рекомбінантного EPO. Через невеликі відмінності між глікойльованою формою штучного рекомбінантного EPO та формою людського EPO заряджені властивості двох молекул дуже малі, і їх можна розрізнити за допомогою методу електрофорезу, який називається ізоелектричним фокусуванням, що є основною стратегією для пряме виявлення штучного рекомбінантного ЕПО. Однак деякі рекомбінантні EPO, що експресуються клітинами, отриманими від людини, не показали відмінностей у глікозилюванні, тому деякі експерти припустили, що екзогенний EPO та ендогенний EPO слід відрізняти різним вмістом ізотопу вуглецю.

Фактично існують обмеження в різних методах тестування на EPO. Наприклад, Ленс Армстронг, легенда американського велоспорту, зізнався, що приймав EPO та інші стимулятори під час своїх семи перемог на Тур де Франс, але він насправді не підтвердив позитивний результат на EPO в жодному допінг-тесті на той час. Нам ще потрібно почекати і побачити, чи це «на ногу вище» чи «на ногу вище».

Як це зробити Нобелівську премію

Останнє слово про зв’язок між EPO та Нобелівською премією з фізіології та медицини 2019 року.

ЕПО є найбільш типовим випадком сприйняття і реакції організму людини на гіпоксію. Тому два лауреати Нобелівської премії Семенза і Реткліфф вибрали EPO як відправну точку для вивчення механізму сприйняття клітинами та адаптації до гіпоксії. Першим кроком було знайти елементи гена EPO, які могли б реагувати на зміни кисню. Семенза ідентифікував ключову некодуючу послідовність із 256 основ на 3' нижньому кінці гена, що кодує EPO, названу елементом відповіді на гіпоксію. Якщо цю послідовність елементів мутувати або видалити, здатність білка EPO реагувати на гіпоксію значно знижується. Якщо ця послідовність елемента злита з нижнім 3'-кінцем інших генів, не пов'язаних з гіпоксією, ці модифіковані гени також виявляють EPO-подібну активаціюв умовах гіпоксії.

Потім Раткліфф і його команда виявили, що цей елемент реакції на гіпоксию присутній не тільки в клітинах нирок або печінки, відповідальних за виробництво EPO, але й у багатьох інших типах клітин, які можуть функціонувати в умовах гіпоксії. Іншими словами, ця відповідь на гіпоксію може бути не специфічною для EPO, а скоріше більш поширеним явищем у клітинах. Ці інші клітини, які не відповідають за виробництво EPO, повинні містити молекули (такі як фактори транскрипції, відповідальні за включення експресії генів), які сприймають зміни в концентрації кисню та зв’язуються з елементами реакції гіпоксії, щоб увімкнути такі гени, як EPO.