Fiziologiya yoki tibbiyot bo‘yicha 2019-yilgi Nobel mukofotining uchta laureati, kichik Uilyam G. Kaelin, Gregg L. Semenza va ser Piter J. Ratkliff 2016-yilda asosiy tibbiyot bo‘yicha Lasker mukofotini hujayralar qanday sezishi va moslashishi haqidagi ishlari uchun qo‘lga kiritgan edi. gipoksiyaga, shuning uchun bu ayniqsa ajablanarli emas edi. Ular gipoksiya qo'zg'atuvchi omil 1 (HIF-1) asosiy molekulasini kashf etdilar va aniqladilar. Bugun biz tadqiqotning kelib chiqishiga qaytmoqchimiz, bu eritropoetin yoki EPO, mo''jizaviy molekula.

Bu qizil qon hujayralari ishlab chiqarishda eng muhim omil

Qizil qon hujayralari qondagi qon hujayralarining eng ko'p turi bo'lib, umurtqali hayvonlarning qoni orqali kislorod va karbonat angidridni tashish uchun asosiy vositadir. Eritrositlar suyak iligida hosil bo'ladi: gematopoetik ildiz hujayralari birinchi navbatda ko'payadi va turli qon hujayralarining progenitatorlariga differensiyalanadi, eritrositlar esa eritrotsitlarga yanada farqlanadi va etuk bo'lishi mumkin. Oddiy sharoitlarda inson eritrotsitlarini ishlab chiqarish darajasi juda past, ammo qon ketish, gemoliz va gipoksiya kabi stress ostida eritrotsitlar ishlab chiqarish tezligi sakkiz martagacha oshirilishi mumkin. Bu jarayonda eritropoetin EPO eng muhim omillardan biridir.

EPO - bu asosan buyrakda sintezlanadigan gormon. Uning kimyoviy tabiati yuqori darajada glikozillangan oqsildir. Nima uchun buyraklarda? Buyraklar orqali har daqiqada taxminan bir litr qon o'tadi, shuning uchun ular qondagi kislorod darajasidagi o'zgarishlarni tez va samarali aniqlashlari mumkin. Qondagi kislorod darajasi past bo'lsa, buyraklar tezda javob beradi va ko'p miqdorda EPO ishlab chiqaradi. Ikkinchisi qon oqimi orqali suyak iligiga aylanadi va u erda eritroid progenitor hujayralarining qizil qon hujayralariga aylanishiga yordam beradi. Yetuk qizil qon tanachalari organizmning kislorod bilan bog‘lanish qobiliyatini yaxshilash uchun suyak iligidan qon aylanish tizimiga chiqariladi. Buyraklar qonda kislorodning ko'payishini sezganda, ular EPO ishlab chiqarishni kamaytiradi, bu esa o'z navbatida suyak iligidagi qizil qon hujayralari miqdorini kamaytiradi.

Bu mukammal sozlash tsiklini yaratadi. Biroq, yuqori balandlikda yashovchi odamlar va ba'zi kamqonlik bilan og'rigan bemorlar ko'pincha qonda kislorod miqdori doimiy ravishda past bo'lgan holatga duch kelishadi, bu esa yuqorida ko'rsatilgan aylanishni yakunlay olmaydi va buyrakni doimiy ravishda EPO chiqarishni rag'batlantiradi, shuning uchun qonda EPO kontsentratsiyasi oddiy odamlarga qaraganda yuqori.

Uni ochish uchun qariyb 80 yil kerak bo'ldi

Ko'pgina yirik kashfiyotlar singari, olimlarning EPO haqidagi tushunchasi ham bir tekis emas, yo'lda savollar va qiyinchiliklar bilan. EPO kontseptsiyasidan o'ziga xos molekulani yakuniy aniqlashgacha deyarli 80 yil o'tdi.

1906 yilda fransuz olimlari Karno va Deflandr anemiyali quyonlarning zardobini oddiy quyonlarga ukol qilib, oddiy quyonlarning plazmasida qizil qon tanachalari miqdori ortib borishini aniqladilar. Ular plazmadagi ba'zi gumoral omillar qizil qon tanachalarini ishlab chiqarishni rag'batlantirishi va tartibga solishi mumkinligiga ishonishdi. Bu birinchi EPO kontseptsiyasi prototipi edi. Afsuski, natijalar keyingi o'n yilliklarda takrorlanmadi, asosan yangi qizil qon hujayralari soni aniq emas edi.

1950 yilda Reissmann va Ruhenstroth-Bauerning parabioz tajribasi haqiqatan ham kuchli dalillar keltirdi. Ular ikkita tirik kalamushning qon aylanish tizimini jarrohlik yo'li bilan bog'lab, birini gipoksik muhitga joylashtirdi, ikkinchisini esa oddiy havo bilan nafas oldi. Natijada ikkala sichqon ham katta miqdorda qizil qon hujayralarini ishlab chiqardi. Hech shubha yo'qki, qon oqimida EPO o'z nomini olgan qizil qon hujayralari ishlab chiqarishni rag'batlantiradigan gormon mavjud. Boshqa tomondan, EPO gipoksiyaga juda sezgir.

EPO qanday molekula? Amerikalik olim Goldvasserga biokimyoviy darajada muammoni nihoyat oydinlashtirish uchun 30 yil kerak bo'ldi. Agar ishchi yaxshi ish qilmoqchi bo'lsa, avvalo asboblarini charxlashi kerak. EPO funktsiyasi yangi qizil qon hujayralarini rag'batlantirishdir, lekinikkinchisining hisobi aniq emas. Qizil qon hujayralarining eng muhim funktsional molekulasi gemoglobinni o'z ichiga olgan gemoglobin bo'lib, uning markazida temir ioni mavjud. Shunday qilib, Goldwasser jamoasi yangi tug'ilgan qizil qon hujayralarini radioaktiv temir izotoplari bilan belgiladi va EPO faolligini aniqlash uchun sezgir usulni ishlab chiqdi. Bu hayvonlar suyuqligi namunalaridan EPO ning juda past konsentratsiyasini (mililitrga nanogramm) ajratib olish va tozalash imkonini beradi. Ammo EPOni izolyatsiya qilish juda qiyin edi. Ular buyrakdan anemiyaga uchragan qo‘y plazmasiga, ankilostoz infektsiyasi tufayli og‘ir temir tanqisligi bo‘lgan bemorlarning siydigiga o‘tishdi va nihoyat, 1977 yilda aplastik anemiya bilan og‘rigan yaponiyalik bemorlarning 2550 litr siydikidan 8 milligramm odam EPO oqsilini tozalashdi.

1985 yilda inson EPO ning protein sekvensiyasi va genlarini klonlash yakunlandi. EPO geni 193 ta aminokislota qoldig'i bo'lgan polipeptidni kodlaydi, u sekretsiya paytida signal peptidi kesilgandan so'ng 166 aminokislota qoldig'idan tashkil topgan etuk oqsilga aylanadi va glikozillanish modifikatsiyasi uchun 4 ta joyni o'z ichiga oladi. 1998 yilda EPO ning NMR eritmasi tuzilishi va EPO ning kristal tuzilishi va uning retseptorlari kompleksi tahlil qilindi. Shu nuqtada, odamlar EPO haqida eng intuitiv tushunchaga ega.

Hozirgacha anemiyani davolash uchun odatda qizil qon tanachalari etishmovchiligini to'ldirish uchun qon quyish kerak edi. Odamlar EPO haqida ko'proq bilib olgach, o'zlarining suyak iligida qizil qon hujayralari ishlab chiqarishni rag'batlantirish uchun uni in'ektsiya qilish muammoni osonlashtirdi. Ammo Goldwasser singari EPO ni bevosita tana suyuqliklaridan tozalash qiyin va unumdorligi past. EPO oqsili va genlar ketma-ketligini aniqlash ko'p miqdorda rekombinant inson EPO ishlab chiqarish imkonini berdi.

Bu Applied Molecular Genetics (Amgen) deb nomlangan biotexnologiya kompaniyasi tomonidan amalga oshirildi. Amgen 1980 yilda atigi yetti a'zodan iborat bo'lib, molekulyar biologiyaning o'sha paytda paydo bo'lgan texnikasi bilan biofarmatsevtika ishlab chiqarishga umid qilgan. Interferon, o'sish gormoni chiqaradigan omil, gepatit B vaktsinasi, epidermal o'sish omili ularning maqsadlari ro'yxatida issiq nomlardan edi, ammo bu urinishlarning hech biri muvaffaqiyat qozonmadi. 1985 yilgacha Xitoyning Tayvanlik olimi Lin Fukun inson EPO genini klonladi va keyin DNK rekombinatsiyasi texnologiyasidan foydalangan holda sintetik EPO ishlab chiqarishni amalga oshirdi.

Rekombinant inson EPO endogen EPO oqsili bilan bir xil ketma-ketlikka ega va shunga o'xshash glikozillanish modifikatsiyasiga ega. Tabiiyki, rekombinant inson EPO ham endogen EPO faolligiga ega. 1989 yil iyun oyida Amgenning birinchi mahsuloti, rekombinant inson eritropoetin Epogen, OIV infektsiyasini davolashda surunkali buyrak etishmovchiligi va kamqonlik tufayli kelib chiqqan anemiyani davolash uchun AQSh FDA tomonidan tasdiqlangan. Epogen sotuvi atigi uch oy ichida 16 million dollardan oshdi. Keyingi yigirma yil ichida Amgen qayta yig'ilgan inson EPO bozorida hukmronlik qildi. Epogen faqat 2010 yilda Amgenga 2,5 milliard dollar daromad keltirdi. 2018 yilda Amgenning fond bozori qiymati 128,8 milliard dollarni tashkil etdi va bu dunyodagi sakkizinchi yirik farmatsevtika kompaniyasiga aylandi.

Shuni ta'kidlash kerakki, Amgen dastlab Goldwasser bilan odamlarning tozalangan EPO oqsillarini ketma-ketlik bilan ta'minlash uchun ishlagan, biroq Goldwasser va Amgen tez orada mafkuraviy tafovutlar tufayli kelishmay qolgan. Goldvasser va uning Chikago universiteti, fundamental tadqiqotlar olib borgan, u kashf etgan gormonni patentlashni hech qachon o'ylamagan va shuning uchun EPOning ulkan tijorat muvaffaqiyati uchun bir tiyin ham olmagan.

Bu -- bu qanday stimulyator

Biz nafas olayotganimizda kislorod hujayralar mitoxondriyalariga kirib, nafas olish zanjirini harakatga keltiradi va tanamizdagi asosiy energiya manbai bo'lgan katta miqdorda ATP ishlab chiqaradi. Anemiya bilan og'rigan odamlarda etarli darajada sog'lom qizil qon tanachalari yo'q va eng tez ta'siri shundaki, ular etarli darajada kislorod olmaydilar, bu esa uzoq vaqt davomida nafas olish muammolariga o'xshab, ularni charchaydi. Rekombinant inson EPO in'ektsiya qilinganida, anemiya bilan og'rigan bemorlarning tanasi ko'proq qizil qon hujayralarini ishlab chiqaradi,ko'proq kislorod olib yuradi va ko'proq energiya molekulasi ATP ishlab chiqaradi, bu simptomlarni samarali ravishda engillashtiradi.

Biroq, ba'zi sport xodimlari ham rekombinant inson EPO haqida o'ylashni boshladilar. Agar EPO turidagi sun'iy rekombinant gormon sportchilarning tanasini ko'proq qizil qon hujayralarini ishlab chiqarishni rag'batlantirish uchun ishlatilsa, sportchilarning kislorod olish va energiya molekulalarini ishlab chiqarish qobiliyatini yaxshilash mumkin, bu esa sportchilarning chidamlilikdagi ish faoliyatini yaxshilashi mumkin. velosiped, uzoq masofalarga yugurish va chang'i sporti kabi tadbirlar. 1980 yilda Journal of Applied Physiology jurnalida chop etilgan maqola qon stimulyatorlari (eritropoetin, sun'iy kislorod tashuvchilar va qon quyish) chidamlilikni 34 foizga oshirishi mumkinligini ko'rsatdi. Agar sportchilar EPO dan foydalansalar, ular yugurish yo‘lakchasida avvalgidan 44 soniya kamroq vaqt ichida 8 kilometr masofani bosib o‘tishlari mumkin. Aslida, velosiped va marafonlar EPO stimulyatorlari uchun eng yomon huquqbuzarlar bo'lgan. 1998 yilgi Tour de France poygasida, Festina jamoasining ispaniyalik shifokori Frantsiya chegarasida 400 shisha sun'iy rekombinant EPO bilan hibsga olindi! Natijada, albatta, butun jamoa Turdan chetlashtirildi va taqiqlandi.

Xalqaro Olimpiya Qo'mitasi 1992 yilgi Barselona o'yinlarida EPO ni taqiqlangan ro'yxatiga qo'shdi, ammo insoniy EPO testini qayta tashkil etish shunchalik qiyin ediki, 2000 yilgi o'yinlardan oldin sportchilar undan foydalanayotganligini samarali aniqlashning hech qanday usuli yo'q edi. Buning bir qancha sabablari bor: 1) tana suyuqliklaridagi EPO miqdori juda past, oddiy odamlarda esa har ml qondagi EPO 130-230 nanogram atrofida; 2) Sun'iy rekombinant EPO ning aminokislotalar tarkibi inson endogen EPO oqsili bilan aynan bir xil, faqat glikozillanish shakli juda oz farq qiladi; 3) EPO ning qondagi yarimparchalanish davri atigi 5-6 soatni tashkil qiladi va oxirgi inyeksiyadan keyin 4-7 kun o'tgach, odatda aniqlanmaydi; 4) Shaxsiy EPO darajasi juda farq qiladi, shuning uchun mutlaq miqdoriy standartni o'rnatish qiyin.

2000 yildan beri WADA siydik testini rekombinant EPO ni bevosita aniqlash uchun yagona ilmiy tekshirish usuli sifatida ishlatib kelmoqda. Sun'iy rekombinant EPO ning glikoillangan shakli va inson EPO o'rtasidagi ozgina farqlar tufayli, ikki molekulaning zaryadlangan xususiyatlari juda kichik va elektroforez usuli bilan ajralib turadi, bu izoelektrik fokuslash deb ataladi, bu esa asosiy strategiyadir. sun'iy rekombinant EPO ni bevosita aniqlash. Biroq, insondan olingan hujayralar tomonidan ifodalangan ba'zi rekombinant EPO glikozillanishda hech qanday farq ko'rsatmadi, shuning uchun ba'zi ekspertlar ekzogen EPO va endogen EPO turli xil uglerod izotoplari tarkibi bilan ajralib turishi kerakligini taklif qildilar.

Aslida, EPO uchun turli xil sinov usullarida hali ham cheklovlar mavjud. Masalan, amerikalik velosport afsonasi Lens Armstrong Tur de Fransdagi yettita g‘alabasi davomida EPO va boshqa stimulyatorlarni qabul qilganini tan oldi, biroq o‘sha paytda u hech qanday doping testida EPO uchun ijobiy natija bermadi. Hali “bir fut balandroq”mi yoki “bir fut balandroq”mi, kutishimiz kerak.

Qanday qilib u Nobel mukofotini oladi

EPO va fiziologiya yoki tibbiyot bo'yicha 2019 yilgi Nobel mukofoti o'rtasidagi bog'liqlik haqida yakuniy so'z.

EPO - bu inson tanasining gipoksiyani idrok etishi va reaktsiyasining eng tipik hodisasidir. Shu sababli, ikkita Nobel mukofoti sovrindorlari Semenza va Ratkliff hujayralarni idrok etish va gipoksiyaga moslashish mexanizmini o'rganish uchun boshlang'ich nuqta sifatida EPO ni tanladilar. Birinchi qadam kislorod o'zgarishiga javob bera oladigan EPO genining elementlarini topish edi. Semenza gipoksiyaga javob elementi deb nomlangan EPO kodlovchi genning 3 'pastki uchida asosiy 256-asosli kodlanmagan ketma-ketlikni aniqladi. Agar ushbu element ketma-ketligi mutatsiyaga uchrasa yoki o'chirilsa, EPO oqsilining gipoksiyaga javob berish qobiliyati sezilarli darajada kamayadi. Agar ushbu elementlar ketma-ketligi gipoksiya bilan bog'liq bo'lmagan boshqa genlarning quyi oqimining 3' uchi bilan birlashtirilgan bo'lsa, bu o'zgartirilgan genlar ham EPOga o'xshash faollashuvni ko'rsatadi.gipoksiya sharoitida.

Keyin Ratcliffe va uning jamoasi ushbu gipoksiyaga javob elementi nafaqat EPO ishlab chiqarish uchun mas'ul bo'lgan buyrak yoki jigar hujayralarida, balki gipoksik sharoitda ham ishlay oladigan boshqa ko'plab hujayra turlarida mavjudligini aniqladi. Boshqacha qilib aytadigan bo'lsak, gipoksiyaga bo'lgan bu javob EPOga xos bo'lmasligi mumkin, aksincha hujayralardagi keng tarqalgan hodisa. EPO ishlab chiqarish uchun mas'ul bo'lmagan bu boshqa hujayralar kislorod kontsentratsiyasidagi o'zgarishlarni sezadigan va EPO kabi genlarni yoqish uchun gipoksik reaktsiya elementlari bilan bog'lanadigan molekulalarni (gen ekspresyonini yoqish uchun mas'ul bo'lgan transkripsiya omillari kabi) o'z ichiga olishi kerak.