Ba người đoạt giải Nobel Sinh lý học và Y học năm 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza và Sir Peter J. Ratcliffe đã giành được Giải thưởng Lasker về Y học cơ bản năm 2016 cho công trình của họ về cách tế bào cảm nhận và thích nghi đến tình trạng thiếu oxy, vì vậy nó không có gì đặc biệt đáng ngạc nhiên. Họ đã phát hiện và xác định được yếu tố 1 gây ra tình trạng thiếu oxy trong phân tử chính (HIF-1). Hôm nay chúng tôi muốn quay trở lại nguồn gốc của nghiên cứu, đó là erythropoietin, hay EPO, một phân tử kỳ diệu.

Là yếu tố quan trọng nhất trong sản xuất hồng cầu

Hồng cầu là loại tế bào có nhiều nhất trong máu và là phương tiện chính để vận chuyển oxy và carbon dioxide qua máu của động vật có xương sống. Hồng cầu được tạo ra trong tủy xương: Các tế bào gốc tạo máu trước tiên sẽ tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào tiền thân của các tế bào máu khác nhau, và các tế bào tiền thân hồng cầu có thể biệt hóa và trưởng thành hơn nữa thành hồng cầu. Trong điều kiện bình thường, tốc độ sản xuất hồng cầu của con người rất thấp, nhưng khi bị căng thẳng như chảy máu, tán huyết và thiếu oxy, tốc độ sản xuất hồng cầu có thể tăng lên tới tám lần. Trong quá trình này, erythropoietin EPO là một trong những yếu tố quan trọng nhất.

EPO là một loại hormone được tổng hợp chủ yếu ở thận. Bản chất hóa học của nó là một loại protein được glycosyl hóa cao. Tại sao ở thận? Khoảng một lít máu chảy qua thận mỗi phút, vì vậy chúng có thể phát hiện nhanh chóng và hiệu quả những thay đổi về nồng độ oxy trong máu. Khi nồng độ oxy trong máu thấp, thận sẽ phản ứng nhanh chóng và tạo ra một lượng lớn EPO. Loại thứ hai lưu thông qua dòng máu đến tủy xương, nơi nó thúc đẩy quá trình chuyển đổi các tế bào tiền thân hồng cầu thành các tế bào hồng cầu. Các tế bào hồng cầu trưởng thành được giải phóng từ tủy xương vào hệ thống tuần hoàn để cải thiện khả năng liên kết với oxy của cơ thể. Khi thận cảm nhận được lượng oxy trong máu tăng lên, chúng sẽ giảm sản xuất EPO, từ đó làm giảm lượng hồng cầu trong tủy xương.

Điều này tạo nên một vòng điều chỉnh hoàn hảo. Tuy nhiên, những người sống ở độ cao lớn và một số bệnh nhân thiếu máu thường gặp phải tình trạng nồng độ oxy trong máu liên tục thấp, không thể hoàn thành quá trình tuần hoàn trên và kích thích thận liên tục tiết ra EPO, do đó nồng độ EPO trong máu cao hơn người bình thường.

Phải mất gần 80 năm để khám phá ra nó

Giống như nhiều khám phá lớn, sự hiểu biết của các nhà khoa học về EPO không được suôn sẻ, với những câu hỏi và thách thức trên đường đi. Phải mất gần 80 năm từ khái niệm về EPO đến việc xác định cuối cùng của phân tử cụ thể.

Năm 1906, các nhà khoa học người Pháp Carnot và Deflandre đã tiêm huyết thanh của những con thỏ bị thiếu máu vào những con thỏ bình thường và phát hiện ra rằng số lượng hồng cầu trong huyết tương của những con thỏ bình thường tăng lên. Họ tin rằng một số yếu tố thể dịch trong huyết tương có thể kích thích và điều chỉnh quá trình sản xuất hồng cầu. Đây là nguyên mẫu khái niệm EPO đầu tiên. Thật không may, kết quả đã không được lặp lại trong những thập kỷ tiếp theo, chủ yếu là do số lượng tế bào hồng cầu mới không chính xác.

Thí nghiệm parabiosis của Reissmann và Ruhenstroth-Bauer năm 1950 đã cung cấp bằng chứng thực sự mạnh mẽ. Họ phẫu thuật liên kết hệ thống tuần hoàn của hai con chuột sống, đặt một con trong môi trường thiếu oxy và con còn lại hít thở không khí bình thường. Kết quả là, cả hai con chuột đều tạo ra một lượng lớn tế bào hồng cầu. Không còn nghi ngờ gì nữa, có một loại hormone trong máu kích thích sản xuất hồng cầu, từ đó EPO được đặt tên. Mặt khác, EPO rất nhạy cảm với tình trạng thiếu oxy.

EPO là phân tử gì? Nhà khoa học người Mỹ Goldwasser đã mất 30 năm để làm sáng tỏ vấn đề ở cấp độ sinh hóa. Người công nhân muốn làm tốt công việc thì trước hết phải mài giũa công cụ của mình. Chức năng của EPO là kích thích các tế bào hồng cầu mới, nhưngsố lượng sau này là không chính xác. Phân tử có chức năng quan trọng nhất trong tế bào hồng cầu là huyết sắc tố chứa heme, chứa ion sắt ở trung tâm của nó. Vì vậy, nhóm của Goldwasser đã dán nhãn các tế bào hồng cầu sơ sinh bằng đồng vị sắt phóng xạ và phát triển một phương pháp nhạy cảm để phát hiện hoạt động của EPO. Điều này cho phép cô lập và tinh chế nồng độ EPO rất thấp (nanogram trên mililit) từ các mẫu chất lỏng động vật. Nhưng việc cô lập EPO là vô cùng khó khăn. Họ chuyển từ thận sang huyết tương cừu thiếu máu, sang nước tiểu của bệnh nhân thiếu sắt trầm trọng do nhiễm giun móc, và cuối cùng, vào năm 1977, đã tinh chế 8 mg protein EPO của người từ 2.550 lít nước tiểu của bệnh nhân Nhật Bản bị thiếu máu bất sản.

Năm 1985, trình tự protein và nhân bản gen của EPO người đã hoàn thành. Gen EPO mã hóa một polypeptit có 193 gốc amino, trở thành protein trưởng thành bao gồm 166 gốc axit amin sau khi peptit tín hiệu được cắt bớt trong quá trình bài tiết và chứa 4 vị trí để biến đổi glycosyl hóa. Năm 1998, cấu trúc dung dịch NMR của EPO và cấu trúc tinh thể của EPO và phức hợp thụ thể của nó đã được phân tích. Lúc này, mọi người đã có những hiểu biết trực quan nhất về EPO.

Từ trước đến nay, điều trị thiếu máu thường phải truyền máu để bổ sung lượng hồng cầu thiếu hụt. Khi mọi người tìm hiểu thêm về EPO, việc tiêm nó để kích thích sản xuất hồng cầu trong tủy xương của chính họ đã khiến vấn đề trở nên dễ dàng hơn. Nhưng tinh chế EPO trực tiếp từ dịch cơ thể, như Goldwasser đã làm, rất khó và hiệu quả thấp. Việc xác định trình tự gen và protein EPO giúp tạo ra EPO người tái tổ hợp với số lượng lớn.

Nó được thực hiện bởi một công ty công nghệ sinh học có tên là Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen được thành lập vào năm 1980 với chỉ bảy thành viên, với hy vọng sản xuất dược phẩm sinh học bằng các kỹ thuật sinh học phân tử mới nổi lúc bấy giờ. Interferon, yếu tố giải phóng hormone tăng trưởng, vắc-xin viêm gan B, yếu tố tăng trưởng biểu bì nằm trong số những cái tên hấp dẫn trong danh sách mục tiêu của họ, nhưng không nỗ lực nào trong số này thành công. Cho đến năm 1985, Lin Fukun, một nhà khoa học Trung Quốc đến từ Đài Loan, Trung Quốc, đã nhân bản gen của EPO người, sau đó nhận ra việc sản xuất EPO tổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp DNA.

EPO người tái tổ hợp có cùng trình tự với protein EPO nội sinh và cũng có sự biến đổi glycosyl hóa tương tự. Đương nhiên, EPO người tái tổ hợp cũng có hoạt tính của EPO nội sinh. Tháng 6 năm 1989, sản phẩm đầu tiên của Amgen, Epogen erythropoietin người tái tổ hợp, đã được FDA Hoa Kỳ chấp thuận để điều trị thiếu máu do suy thận mãn tính và thiếu máu trong điều trị nhiễm HIV. Doanh thu của Epogen đạt 16 triệu đô la chỉ trong ba tháng. Trong hai thập kỷ tiếp theo, Amgen đã thống trị thị trường EPO người được lắp ráp lại. Epogen đã mang lại cho Amgen 2,5 tỷ USD doanh thu chỉ riêng trong năm 2010. Năm 2018, giá trị thị trường chứng khoán của Amgen là 128,8 tỷ USD, trở thành công ty dược phẩm lớn thứ tám trên thế giới.

Điều đáng chú ý là Amgen ban đầu đã làm việc với Goldwasser để cung cấp các protein EPO tinh khiết của con người để giải trình tự, nhưng Goldwasser và Amgen đã sớm bất hòa do sự khác biệt về ý thức hệ. Goldwasser và Đại học Chicago của ông, nơi thực hiện nghiên cứu cơ bản, chưa bao giờ nghĩ đến việc cấp bằng sáng chế cho loại hormone mà ông đã phát hiện ra, và vì vậy đã không nhận được một xu nào cho thành công thương mại to lớn của EPO.

Nó -- nó là chất kích thích như thế nào

Khi chúng ta thở, oxy đi vào ty thể của tế bào để điều khiển chuỗi hô hấp và tạo ra một lượng lớn ATP, nguồn năng lượng chính trong cơ thể chúng ta. Những người thiếu máu không có đủ các tế bào hồng cầu khỏe mạnh và hậu quả tức thời nhất là họ không hấp thụ đủ oxy, khiến họ cảm thấy mệt mỏi, tương tự như các vấn đề về hô hấp trong thời gian dài. Khi được tiêm EPO người tái tổ hợp, cơ thể bệnh nhân thiếu máu sẽ tạo ra nhiều tế bào hồng cầu hơn,mang nhiều oxy hơn và tạo ra nhiều phân tử năng lượng ATP hơn, làm giảm các triệu chứng một cách hiệu quả.

Tuy nhiên, một số nhân viên thể thao cũng đã bắt đầu nghĩ đến EPO tái tổ hợp của con người. Nếu sử dụng hormone tái tổ hợp nhân tạo loại EPO để kích thích cơ thể vận động viên sản xuất nhiều tế bào hồng cầu hơn, thì có thể cải thiện khả năng lấy oxy và sản xuất các phân tử năng lượng của vận động viên, điều này cũng có thể cải thiện thành tích của vận động viên về sức bền các sự kiện như đạp xe, chạy đường dài và trượt tuyết băng đồng. Một bài báo năm 1980 trên Tạp chí Sinh lý học Ứng dụng cho thấy các chất kích thích máu (erythropoietin, chất mang oxy nhân tạo và truyền máu) có thể tăng sức chịu đựng lên 34%. Nếu các vận động viên sử dụng EPO, họ có thể chạy 8 km trên máy chạy bộ trong thời gian ngắn hơn 44 giây so với trước đây. Trên thực tế, đạp xe và chạy marathon là những kẻ phạm tội tồi tệ nhất đối với chất kích thích EPO. Trong Tour de France năm 1998, một bác sĩ của đội Tây Ban Nha cho đội Festina đã bị bắt tại biên giới Pháp với 400 chai EPO tái tổ hợp nhân tạo! Tất nhiên, kết quả là toàn bộ đội bị đuổi khỏi Tour và bị cấm.

Ủy ban Olympic Quốc tế đã thêm EPO vào danh sách bị cấm tại Thế vận hội Barcelona năm 1992, nhưng việc tổ chức lại việc thử nghiệm EPO trên người khó khăn đến mức trước Thế vận hội năm 2000, không có cách nào để phát hiện một cách hiệu quả liệu các vận động viên có sử dụng nó hay không. Có một số lý do: 1) Hàm lượng EPO trong dịch cơ thể rất thấp, và EPO mỗi ml máu ở người bình thường là khoảng 130-230 nanogam; 2) Thành phần axit amin của EPO tái tổ hợp nhân tạo hoàn toàn giống với thành phần của protein EPO nội sinh của con người, chỉ có hình thức glycosyl hóa hơi khác một chút; 3) Thời gian bán hủy của EPO trong máu chỉ là 5-6 giờ và thường không thể phát hiện được sau 4-7 ngày kể từ lần tiêm cuối cùng; 4) Mức độ EPO của từng cá nhân rất khác nhau nên khó thiết lập một tiêu chuẩn định lượng tuyệt đối.

Từ năm 2000, WADA đã sử dụng xét nghiệm nước tiểu làm phương pháp xác minh khoa học duy nhất để phát hiện trực tiếp EPO tái tổ hợp. Do có sự khác biệt nhỏ giữa dạng glycoyl hóa của EPO tái tổ hợp nhân tạo và EPO của con người, các đặc tính tích điện của hai phân tử là rất nhỏ và có thể được phân biệt bằng phương pháp điện di gọi là tập trung đẳng điện, đây là chiến lược chính cho phát hiện trực tiếp EPO tái tổ hợp nhân tạo. Tuy nhiên, một số EPO tái tổ hợp được biểu hiện bởi các tế bào có nguồn gốc từ con người cho thấy không có sự khác biệt trong quá trình glycosyl hóa, vì vậy một số chuyên gia cho rằng EPO ngoại sinh và EPO nội sinh nên được phân biệt bằng hàm lượng đồng vị carbon khác nhau.

Trên thực tế, vẫn còn những hạn chế trong các phương pháp thử nghiệm khác nhau đối với EPO. Ví dụ, Lance Armstrong, huyền thoại đua xe đạp người Mỹ, thừa nhận đã sử dụng EPO và các chất kích thích khác trong 7 lần vô địch Tour de France, nhưng anh ta không thực sự được xác nhận dương tính với EPO trong bất kỳ cuộc kiểm tra doping nào vào thời điểm đó. Chúng ta vẫn phải chờ xem nó "cao hơn một chân" hay "cao hơn một chân".

Làm thế nào để nó tạo ra một giải thưởng Nobel

Lời cuối cùng về mối liên hệ giữa EPO và Giải thưởng Nobel về Sinh lý học và Y học năm 2019.

EPO là trường hợp điển hình nhất về nhận thức và phản ứng của cơ thể con người đối với tình trạng thiếu oxy. Vì vậy, Semenza và Ratcliffe, hai nhà khoa học đoạt giải Nobel, đã chọn EPO làm điểm xuất phát để nghiên cứu cơ chế nhận biết và thích nghi của tế bào với tình trạng thiếu oxy. Bước đầu tiên là tìm ra các yếu tố của gen EPO có thể đáp ứng với sự thay đổi oxy. Semenza đã xác định trình tự không mã hóa cơ sở 256 chính ở đầu 3' xuôi dòng của gen mã hóa EPO, được đặt tên là yếu tố phản ứng thiếu oxy. Nếu trình tự phần tử này bị đột biến hoặc bị xóa, khả năng phản ứng với tình trạng thiếu oxy của protein EPO sẽ giảm đi rất nhiều. Nếu trình tự phần tử này được hợp nhất với đầu 3' xuôi dòng của các gen khác không liên quan đến tình trạng thiếu oxy, thì các gen bị biến đổi này cũng cho thấy sự kích hoạt giống như EPOtrong điều kiện thiếu oxy.

Sau đó, Ratcliffe và nhóm của ông đã phát hiện ra rằng yếu tố phản ứng thiếu oxy này không chỉ có trong tế bào thận hoặc gan chịu trách nhiệm sản xuất EPO mà còn có trong nhiều loại tế bào khác có thể hoạt động trong điều kiện thiếu oxy. Nói cách khác, phản ứng đối với tình trạng thiếu oxy này có thể không đặc trưng cho EPO, mà là một hiện tượng phổ biến hơn trong các tế bào. Các tế bào khác này, không chịu trách nhiệm sản xuất EPO, phải chứa các phân tử (chẳng hạn như các yếu tố phiên mã chịu trách nhiệm kích hoạt biểu hiện gen) cảm nhận được sự thay đổi nồng độ oxy và liên kết với các yếu tố phản ứng thiếu oxy để kích hoạt các gen như EPO.