A 2019-es fiziológiai és orvosi Nobel-díj három nyertese, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza és Sir Peter J. Ratcliffe már elnyerte a 2016-os Lasker-díjat az alapvető orvostudományban a sejtek érzékelésének és alkalmazkodásának vizsgálatával kapcsolatos munkájukért. hipoxiára, szóval ez nem volt különösebben meglepő. Felfedezték és azonosították a kulcsmolekulát, a hipoxia-indukálható 1-es faktort (HIF-1). Ma vissza akarunk térni a tanulmány eredetéhez, amely az eritropoetin, vagyis az EPO, egy csodamolekula.

Ez a legfontosabb tényező a vörösvérsejt-termelésben

A vörösvérsejtek a vérben a legelterjedtebb vérsejtek, és a gerincesek vérén keresztül az oxigén és a szén-dioxid szállításának fő közege. Az eritrociták a csontvelőben keletkeznek: A vérképző őssejtek először szaporodnak és differenciálódnak különböző vérsejtek progenitoraivá, az eritroid progenitorok pedig tovább differenciálódhatnak és vörösvértestekké érhetnek. Normál körülmények között az emberi eritrocita termelési sebesség nagyon alacsony, de stressz esetén, mint például vérzés, hemolízis és hipoxia, a vörösvértest-termelés sebessége akár nyolcszorosára is megnőhet. Ebben a folyamatban az eritropoetin EPO az egyik legfontosabb tényező.

Az EPO egy hormon, amelyet főként a vesében szintetizálnak. Kémiai természete erősen glikozilált fehérje. Miért a vesékben? Percenként körülbelül egy liter vér áramlik át a vesén, így gyorsan és hatékonyan észlelik a vér oxigénszintjének változását. Ha a vér oxigénszintje alacsony, a vesék gyorsan reagálnak, és nagy mennyiségű EPO-t termelnek. Ez utóbbi a véráramon keresztül a csontvelőbe kering, ahol elősegíti az eritroid progenitor sejtek vörösvérsejtekké történő átalakulását. Az érett vörösvérsejtek a csontvelőből szabadulnak fel a keringési rendszerbe, hogy javítsák a szervezet oxigénkötő képességét. Amikor a vesék érzékelik az oxigén növekedését a vérben, csökkentik az EPO-termelést, ami viszont csökkenti a vörösvérsejtek mennyiségét a csontvelőben.

Ez tökéletes beállítási hurkot eredményez. A magasban élők és egyes vérszegények azonban gyakran szembesülnek a folyamatosan alacsony véroxigénszint állapotával, ami nem tudja teljessé tenni a fenti keringést és serkenti a vesét az EPO folyamatos kiválasztására, így a vér EPO koncentrációja magasabb, mint a hétköznapi embereknél.

Közel 80 évbe telt, mire feltárták

Sok jelentős felfedezéshez hasonlóan a tudósok az EPO-val kapcsolatos ismeretei sem voltak zökkenőmentesek, kérdések és kihívások merültek fel az út során. Közel 80 év telt el az EPO koncepciójától a konkrét molekula végső meghatározásáig.

Carnot és Deflandre francia tudósok 1906-ban vérszegény nyulak szérumát fecskendezték normál nyulakra, és megállapították, hogy a normál nyulak plazmájában megnőtt a vörösvértestek száma. Úgy gondolták, hogy a plazmában egyes humorális tényezők serkenthetik és szabályozhatják a vörösvértestek termelését. Ez volt az első EPO koncepció prototípus. Sajnos az eredményeket a következő évtizedekben nem sikerült megismételni, főként azért, mert az új vörösvértestek száma nem volt pontos.

Reissmann és Ruhenstroth-Bauer 1950-es parabióziskísérlete igazán erős bizonyítékot szolgáltatott. Sebészeti úton összekapcsolták két élő patkány keringési rendszerét, az egyiket hipoxiás környezetbe helyezték, a másikat pedig normális levegőt lélegeztek. Ennek eredményeként mindkét egér hatalmas mennyiségű vörösvértestet termelt. Kétségtelen, hogy a véráramban van egy hormon, amely serkenti a vörösvértestek termelését, és innen kapta a nevét az EPO. Másrészt az EPO nagyon érzékeny a hipoxiára.

Milyen molekula az EPO? Goldwasser amerikai tudósnak 30 évbe telt, mire végre tisztázta a problémát biokémiai szinten. Ha a munkás jó munkát akar végezni, először meg kell éleznie a szerszámait. Az EPO feladata az új vörösvérsejtek serkentése, deaz utóbbiak számolása nem pontos. A vörösvérsejtek legfontosabb funkcionális molekulája a hemoglobint tartalmazó hem, amelynek középpontjában vasion található. Ezért Goldwasser csapata az újszülött vörösvértesteket radioaktív vasizotópokkal jelölte meg, és érzékeny módszert fejlesztett ki az EPO aktivitás kimutatására. Ez lehetővé teszi nagyon alacsony koncentrációjú EPO (nanogram per milliliter) izolálását és tisztítását állati folyadékmintákból. De az EPO elkülönítése rendkívül nehéz volt. Áttértek a vese helyett anémiás birkaplazmára, a horgosféregfertőzés miatt súlyos vashiányos betegek vizeletére, végül 1977-ben aplasztikus vérszegénységben szenvedő japán betegek 2550 liter vizeletéből 8 milligramm humán EPO fehérjét tisztítottak meg.

1985-ben befejeződött a humán EPO fehérjeszekvenálása és génklónozása. Az EPO gén egy 193 aminosavból álló polipeptidet kódol, amely a szignálpeptid szekréció során történő levágása után 166 aminosavból álló érett fehérjévé válik, és 4 helyet tartalmaz a glikoziláció módosítására. 1998-ban az EPO NMR oldatszerkezetét, valamint az EPO és receptorkomplexének kristályszerkezetét elemezték. Ezen a ponton az emberek a leginkább intuitív módon értik az EPO-t.

Eddig a vérszegénység kezelése általában vérátömlesztést igényelt a vörösvértest-hiány pótlására. Ahogy az emberek többet tanulnak az EPO-ról, a saját csontvelőjükben a vörösvérsejt-termelés serkentésére adott injekcióval könnyebbé vált a probléma. De az EPO-t közvetlenül a testnedvekből tisztítani, ahogyan azt Goldwasser tette, nehéz és alacsony a hozam. Az EPO fehérje és génszekvencia meghatározása lehetővé tette rekombináns humán EPO nagy mennyiségben történő előállítását.

Ezt az Applied Molecular Genetics (Amgen) nevű biotechnológiai cég végezte. Az Amgen-t 1980-ban alapították, mindössze hét taggal, abban a reményben, hogy a molekuláris biológia akkor még feltörekvő technikáival biogyógyszereket készíthet. Az interferon, a növekedési hormon felszabadító faktor, a hepatitis B vakcina, az epidermális növekedési faktor szerepelt a népszerű nevek között a célpontjaik listáján, de egyik kísérlet sem járt sikerrel. 1985-ig Lin Fukun, egy tajvani kínai tudós klónozta az emberi EPO génjét, majd DNS-rekombinációs technológia segítségével megvalósította a szintetikus EPO előállítását.

A rekombináns humán EPO-nak ugyanaz a szekvenciája, mint az endogén EPO-fehérjének, és hasonló glikozilációs módosításokkal rendelkezik. Természetesen a rekombináns humán EPO is rendelkezik endogén EPO aktivitással. 1989 júniusában az Amgen első termékét, a rekombináns humán eritropoetint, az Epogen-t jóváhagyta az amerikai FDA a krónikus veseelégtelenség és a HIV-fertőzés kezelésében fellépő vérszegénység kezelésére. Az Epogen eladásai mindössze három hónap alatt meghaladták a 16 millió dollárt. A következő két évtizedben az Amgen uralta az újra összeszerelt emberi EPO piacát. Az Epogen csak 2010-ben 2,5 milliárd dollár bevételt hozott az Amgennek. 2018-ban az Amgen tőzsdei értéke 128,8 milliárd dollár volt, ezzel a világ nyolcadik legnagyobb gyógyszeripari vállalata.

Érdemes megjegyezni, hogy az Amgen kezdetben a Goldwasserrel dolgozott, hogy tisztított humán EPO fehérjéket biztosítsanak a szekvenáláshoz, de a Goldwasser és az Amgen hamarosan kiesett az ideológiai különbségek miatt. Goldwasser és Chicagói Egyeteme, amely alapkutatást végzett, soha nem gondolt arra, hogy szabadalmaztassák az általa felfedezett hormont, így egy fillért sem kaptak az EPO hatalmas kereskedelmi sikeréért.

Ez… milyen stimuláns

Amikor lélegzünk, az oxigén belép a sejtek mitokondriumaiba, hogy megmozgassa a légzési láncot, és hatalmas mennyiségű ATP-t termeljen, amely szervezetünk fő energiaforrása. A vérszegény embereknek nincs elég egészséges vörösvérsejtje, és a legközvetlenebb hatás az, hogy nem vesznek fel elegendő oxigént, ami miatt fáradtnak érzik magukat, hasonlóan a hosszú távon jelentkező légzési problémákhoz. Ha rekombináns humán EPO-t injektálnak, az anémiás betegek szervezete több vörösvérsejtet termel,több oxigént szállítanak, és több ATP energiamolekulát termelnek, hatékonyan enyhítve a tüneteket.

Néhány sportoló azonban a rekombináns humán EPO-ra is gondolt. Ha az EPO típusú mesterséges rekombináns hormont arra használjuk, hogy a sportolók szervezetét több vörösvérsejt termelésére ösztönözzük, javítható a sportolók oxigénfelvételi és energiamolekulák termelő képessége, ami javíthatja a sportolók teljesítményét az állóképesség terén is. olyan eseményeket, mint a kerékpározás, a hosszú távú futás és a sífutás. A Journal of Applied Physiology 1980-as tanulmánya kimutatta, hogy a vérserkentő szerek (eritropoetin, mesterséges oxigénhordozók és vérátömlesztés) 34 százalékkal növelhetik az állóképességet. Ha a sportolók használják az EPO-t, akkor a korábbinál 44 másodperccel rövidebb idő alatt tudnak 8 kilométert futni a futópadon. Valójában a kerékpározás és a maratoni futás volt a legrosszabb szabálysértés az EPO-stimulánsokkal szemben. Az 1998-as Tour de France során a Festina csapat spanyol csapatorvosát letartóztatták a francia határon 400 üveg mesterséges rekombináns EPO-val! Ennek persze az lett az eredménye, hogy az egész csapatot kirúgták a Tourból és eltiltották.

A Nemzetközi Olimpiai Bizottság felvette az EPO-t az 1992-es barcelonai játékokon tiltott listájára, de az emberi EPO-tesztek átszervezése annyira nehéz volt, hogy a 2000-es játékok előtt nem lehetett hatékonyan kimutatni, hogy a sportolók használták-e. Ennek több oka is van: 1) A testfolyadékok EPO-tartalma nagyon alacsony, és az EPO/ml vér normál emberben körülbelül 130-230 nanogramm; 2) A mesterséges rekombináns EPO aminosav-összetétele pontosan ugyanaz, mint a humán endogén EPO fehérjéé, csak a glikoziláció formája nagyon kis mértékben eltér; 3) Az EPO felezési ideje a vérben mindössze 5-6 óra, és általában nem mutatható ki 4-7 nappal az utolsó injekció után; 4) Az egyéni EPO-szint nagyon eltérő, ezért nehéz abszolút mennyiségi szabványt megállapítani.

A WADA 2000 óta a vizeletvizsgálatot használja, mint az egyetlen tudományos igazolási módszert a rekombináns EPO közvetlen kimutatására. A mesterséges rekombináns EPO és a humán EPO glikoilezett formája közötti csekély különbségek miatt a két molekula töltött tulajdonságai nagyon kicsik, és az izoelektromos fókuszálásnak nevezett elektroforézis módszerrel megkülönböztethetők, amely a fő stratégia a a mesterséges rekombináns EPO közvetlen kimutatása. Azonban néhány humán eredetű sejtek által expresszált rekombináns EPO nem mutatott különbséget a glikozilációban, ezért egyes szakértők azt javasolták, hogy az exogén EPO-t és az endogén EPO-t meg kell különböztetni a szénizotóp-tartalommal.

Valójában még mindig vannak korlátozások az EPO különböző vizsgálati módszereiben. Például Lance Armstrong, az amerikai kerékpáros legenda elismerte, hogy hét Tour de France-győzelme alatt EPO-t és más stimulánsokat szedett, de akkoriban egyetlen doppingteszten sem erősítették meg az EPO-t. Még várnunk kell, hogy „egy lábbal magasabban” vagy „egy lábbal magasabban” áll-e.

Hogyan lesz belőle Nobel-díj

Egy utolsó szó az EPO és a 2019-es fiziológiai és orvosi Nobel-díj kapcsolatáról.

Az EPO az emberi test hipoxia észlelésének és válaszának legjellemzőbb esete. Ezért Semenza és Ratcliffe, a két Nobel-díjas az EPO-t választotta kiindulási pontnak a sejtészlelés és a hipoxiához való alkalmazkodás mechanizmusának tanulmányozására. Az első lépés az EPO gén azon elemeinek megtalálása volt, amelyek reagálni tudnak az oxigénváltozásokra. A Semenza egy kulcsfontosságú, 256 bázisból álló, nem kódoló szekvenciát azonosított az EPO-t kódoló gén 3' downstream végén, amelyet hipoxia válaszelemnek neveztek el. Ha ez az elemszekvencia mutálódik vagy törlődik, az EPO fehérje hipoxiára reagáló képessége nagymértékben csökken. Ha ezt az elemszekvenciát más gének downstream 3' végéhez fuzionálják, amelyek nem kapcsolódnak hipoxiához, ezek a módosított gének szintén EPO-szerű aktiválást mutatnak.hipoxiás körülmények között.

Ratcliffe és csapata ezután felfedezte, hogy ez a hipoxiás válaszelem nemcsak az EPO termeléséért felelős vese- vagy májsejtekben van jelen, hanem sok más sejttípusban is, amelyek hipoxiás körülmények között működhetnek. Más szavakkal, ez a hipoxiára adott válasz nem specifikus az EPO-ra, hanem inkább a sejtekben elterjedtebb jelenség. Ezeknek a többi sejtnek, amelyek nem felelősek az EPO termeléséért, olyan molekulákat kell tartalmazniuk (például a génexpresszió bekapcsolásáért felelős transzkripciós faktorokat), amelyek érzékelik az oxigénkoncentráció változásait, és kötődnek a hipoxiás válaszelemekhez, hogy bekapcsolják az olyan géneket, mint az EPO.