ผู้ชนะรางวัลโนเบลสาขาสรีรวิทยาหรือการแพทย์ประจำปี 2019 ทั้งสามคน ได้แก่ William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza และ Sir Peter J. Ratcliffe ได้รับรางวัล Lasker Prize ประจำปี 2016 สาขา Basic Medicine จากผลงานของพวกเขาเกี่ยวกับวิธีที่เซลล์รับความรู้สึกและปรับตัว ต่อภาวะขาดออกซิเจน จึงไม่น่าแปลกใจอย่างยิ่ง พวกเขาค้นพบและระบุปัจจัยสำคัญที่เหนี่ยวนำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจนในระดับโมเลกุล 1 (HIF-1) วันนี้เราขอย้อนไปถึงต้นตอของการศึกษา นั่นก็คือ erythropoietin หรือ EPO โมเลกุลมหัศจรรย์

เป็นปัจจัยที่สำคัญที่สุดในการสร้างเม็ดเลือดแดง

เซลล์เม็ดเลือดแดงเป็นเซลล์เม็ดเลือดที่มีมากที่สุดในเลือด และเป็นตัวกลางหลักในการขนส่งออกซิเจนและคาร์บอนไดออกไซด์ผ่านทางเลือดของสัตว์มีกระดูกสันหลัง เซลล์เม็ดเลือดแดงถูกสร้างขึ้นในไขกระดูก: เซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดจะเพิ่มจำนวนและแยกความแตกต่างเป็นต้นกำเนิดของเซลล์เม็ดเลือดต่างๆ และต้นกำเนิดของเม็ดเลือดแดงสามารถสร้างความแตกต่างและเติบโตเป็นเม็ดเลือดแดงได้ ภายใต้สภาวะปกติ อัตราการผลิตเม็ดเลือดแดงของมนุษย์จะต่ำมาก แต่ภายใต้ความเครียด เช่น เลือดออก เม็ดเลือดแดงแตก และขาดออกซิเจน อัตราการผลิตเม็ดเลือดแดงสามารถเพิ่มขึ้นได้ถึงแปดเท่า ในกระบวนการนี้ EPO ของ erythropoietin เป็นหนึ่งในปัจจัยที่สำคัญที่สุด

EPO เป็นฮอร์โมนที่สังเคราะห์ขึ้นส่วนใหญ่ในไต ลักษณะทางเคมีของมันคือโปรตีนไกลโคซิเลตสูง ทำไมในไต? เลือดประมาณหนึ่งลิตรไหลผ่านไตทุกๆ นาที จึงสามารถตรวจจับการเปลี่ยนแปลงของระดับออกซิเจนในเลือดได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ เมื่อระดับออกซิเจนในเลือดต่ำ ไตจะตอบสนองอย่างรวดเร็วและสร้าง EPO จำนวนมาก หลังไหลเวียนผ่านกระแสเลือดไปยังไขกระดูกซึ่งส่งเสริมการเปลี่ยนเซลล์ต้นกำเนิดของอีรีทรอยด์เป็นเซลล์เม็ดเลือดแดง เซลล์เม็ดเลือดแดงที่โตเต็มที่จะถูกปล่อยออกจากไขกระดูกเข้าสู่ระบบไหลเวียนโลหิตเพื่อปรับปรุงความสามารถของร่างกายในการจับกับออกซิเจน เมื่อไตสัมผัสได้ถึงการเพิ่มขึ้นของออกซิเจนในเลือด ไตจะลดการผลิต EPO ซึ่งจะลดปริมาณเซลล์เม็ดเลือดแดงในไขกระดูก

สิ่งนี้ทำให้วงการปรับที่สมบูรณ์แบบ อย่างไรก็ตาม ผู้ที่อาศัยอยู่บนที่สูงและผู้ป่วยโรคโลหิตจางบางรายมักพบภาวะออกซิเจนในเลือดต่ำอย่างต่อเนื่อง ทำให้ไม่สามารถไหลเวียนได้เต็มที่ และกระตุ้นให้ไตหลั่ง EPO อย่างต่อเนื่อง จึงทำให้ความเข้มข้นของ EPO ในเลือดสูงกว่าคนทั่วไป

ใช้เวลาเกือบ 80 ปีในการค้นพบ

เช่นเดียวกับการค้นพบสำคัญๆ มากมาย ความเข้าใจของนักวิทยาศาสตร์เกี่ยวกับ EPO ไม่ได้ดำเนินไปอย่างราบรื่น โดยมีคำถามและความท้าทายระหว่างทาง ใช้เวลาเกือบ 80 ปีตั้งแต่แนวคิดของ EPO จนถึงการกำหนดขั้นสุดท้ายของโมเลกุลที่เฉพาะเจาะจง

ในปี 1906 นักวิทยาศาสตร์ชาวฝรั่งเศส Carnot และ Deflandre ได้ฉีดซีรั่มของกระต่ายที่เป็นโรคโลหิตจางให้กับกระต่ายปกติ และพบว่าจำนวนเม็ดเลือดแดงในพลาสมาของกระต่ายปกตินั้นเพิ่มขึ้น พวกเขาเชื่อว่าปัจจัยทางร่างกายบางอย่างในพลาสมาสามารถกระตุ้นและควบคุมการผลิตเซลล์เม็ดเลือดแดงได้ นี่เป็นต้นแบบแนวคิด EPO ตัวแรก น่าเสียดายที่ผลลัพธ์ไม่ได้ถูกทำซ้ำในทศวรรษต่อๆ มา ส่วนใหญ่เป็นเพราะการนับจำนวนเซลล์เม็ดเลือดแดงใหม่ไม่ถูกต้อง

การทดลองพาราไบโอซิสของ Reissmann และ Ruhenstroth-Bauer ในปี 1950 ให้หลักฐานที่ชัดเจนมาก พวกเขาทำการผ่าตัดเชื่อมโยงระบบไหลเวียนเลือดของหนูที่มีชีวิต 2 ตัว โดยให้หนูตัวหนึ่งอยู่ในสภาพแวดล้อมที่ขาดออกซิเจน และอีกตัวหนึ่งหายใจด้วยอากาศปกติ เป็นผลให้หนูทั้งสองผลิตเซลล์เม็ดเลือดแดงจำนวนมาก ไม่ต้องสงสัยเลยว่ามีฮอร์โมนในกระแสเลือดที่กระตุ้นการผลิตเซลล์เม็ดเลือดแดง ซึ่ง EPO ได้รับชื่อนี้ ในทางกลับกัน EPO ไวต่อภาวะขาดออกซิเจนมาก

EPO คือโมเลกุลอะไร Goldwasser นักวิทยาศาสตร์ชาวอเมริกันใช้เวลา 30 ปีในการไขปัญหาในระดับชีวเคมีในที่สุด หากคนงานต้องการทำงานให้ดี เขาต้องลับเครื่องมือให้คมก่อน หน้าที่ของ EPO คือกระตุ้นการสร้างเม็ดเลือดแดงใหม่แต่การนับหลังไม่ถูกต้อง โมเลกุลการทำงานที่สำคัญที่สุดในเซลล์เม็ดเลือดแดงคือเฮโมโกลบินที่มีฮีมซึ่งมีไอออนเหล็กอยู่ตรงกลาง ดังนั้น ทีมของ Goldwasser จึงติดฉลากเซลล์เม็ดเลือดแดงแรกเกิดด้วยไอโซโทปเหล็กกัมมันตภาพรังสี และพัฒนาวิธีการที่ละเอียดอ่อนในการตรวจจับกิจกรรม EPO ทำให้สามารถแยกและทำให้บริสุทธิ์ EPO ที่มีความเข้มข้นต่ำมาก (นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร) จากตัวอย่างของเหลวจากสัตว์ได้ แต่การแยก EPO นั้นยากมาก พวกเขาเปลี่ยนจากไตเป็นพลาสมาแกะที่มีภาวะโลหิตจาง มาเป็นปัสสาวะของผู้ป่วยที่มีภาวะขาดธาตุเหล็กอย่างรุนแรงเนื่องจากการติดเชื้อพยาธิปากขอ และในที่สุด ในปี 1977 ได้ทำให้โปรตีน EPO ของมนุษย์บริสุทธิ์ 8 มิลลิกรัมจากปัสสาวะ 2,550 ลิตรของผู้ป่วยชาวญี่ปุ่นที่เป็นโรคโลหิตจาง aplastic

ในปี 1985 การจัดลำดับโปรตีนและการโคลนยีนของ EPO ของมนุษย์เสร็จสมบูรณ์ ยีน EPO เข้ารหัสโพลีเปปไทด์ที่มีอะมิโนเรซิดิว 193 ตัว ซึ่งกลายเป็นโปรตีนที่โตเต็มที่ซึ่งประกอบด้วยกรดอะมิโนเรซิดิว 166 ตัวหลังจากที่เปปไทด์ส่งสัญญาณถูกตัดออกระหว่างการหลั่ง และมีตำแหน่ง 4 แห่งสำหรับการดัดแปลงไกลโคซิเลชัน ในปี 1998 ได้มีการวิเคราะห์โครงสร้างสารละลาย NMR ของ EPO และโครงสร้างผลึกของ EPO และคอมเพล็กซ์ตัวรับ ณ จุดนี้ ผู้คนมีความเข้าใจโดยสัญชาตญาณของ EPO มากที่สุด

จนถึงปัจจุบัน การรักษาโรคโลหิตจางมักจะต้องมีการถ่ายเลือดเพื่อเติมเซลล์เม็ดเลือดแดงที่ขาดไป เมื่อผู้คนเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ EPO การฉีด EPO เพื่อกระตุ้นการสร้างเซลล์เม็ดเลือดแดงในไขกระดูกทำให้ปัญหาง่ายขึ้น แต่การทำให้ EPO บริสุทธิ์โดยตรงจากของเหลวในร่างกายอย่างที่ Goldwasser ทำนั้นทำได้ยากและให้ผลตอบแทนต่ำ การหาโปรตีน EPO และลำดับยีนทำให้สามารถผลิต EPO ของมนุษย์แบบรีคอมบิแนนท์ได้ในปริมาณมาก

ดำเนินการโดยบริษัทเทคโนโลยีชีวภาพชื่อ Applied Molecular Genetics (Amgen) แอมเจนก่อตั้งขึ้นในปี 2523 โดยมีสมาชิกเพียง 7 คน โดยหวังว่าจะผลิตยาชีวเวชภัณฑ์ด้วยเทคนิคทางอณูชีววิทยาที่กำลังเกิดขึ้นในขณะนั้น Interferon, ปัจจัยการปลดปล่อยฮอร์โมนการเจริญเติบโต, วัคซีนป้องกันไวรัสตับอักเสบบี, ปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังเป็นหนึ่งในชื่อที่ร้อนแรงในรายชื่อเป้าหมาย แต่ไม่มีความพยายามใดที่ประสบความสำเร็จ จนกระทั่งปี 1985 Lin Fukun นักวิทยาศาสตร์ชาวจีนจากไต้หวัน ประเทศจีน ได้โคลนยีนของ EPO ของมนุษย์ จากนั้นจึงได้ผลิต EPO สังเคราะห์โดยใช้เทคโนโลยีการรวมตัวกันของ DNA

EPO ของมนุษย์ชนิดลูกผสมมีลำดับเดียวกันกับโปรตีน EPO ภายในร่างกาย และยังมีการดัดแปลงไกลโคซิเลชันที่คล้ายคลึงกันอีกด้วย โดยธรรมชาติแล้ว EPO ของมนุษย์ชนิดลูกผสมยังมีกิจกรรมของ EPO ภายในร่างกายด้วย ในเดือนมิถุนายน พ.ศ. 2532 ผลิตภัณฑ์แรกของแอมเจน คือ อีรีโทรพอยอีตินอีพอเจนชนิดรีคอมบิแนนท์ของมนุษย์ ได้รับการอนุมัติจากองค์การอาหารและยาแห่งสหรัฐอเมริกาสำหรับการรักษาโรคโลหิตจางที่เกิดจากไตวายเรื้อรังและโรคโลหิตจางในการรักษาการติดเชื้อเอชไอวี ยอดขาย Epogen สูงถึง 16 ล้านดอลลาร์ในเวลาเพียงสามเดือน ในอีกสองทศวรรษข้างหน้า แอมเจนครองตลาด EPO ที่มนุษย์ประกอบขึ้นใหม่ Epogen ทำให้แอมเจนมีรายได้ 2.5 พันล้านดอลลาร์ในปี 2553 เพียงปีเดียว ในปี 2561 มูลค่าตลาดหุ้นของแอมเจนอยู่ที่ 128.8 พันล้านดอลลาร์ ทำให้เป็นบริษัทเวชภัณฑ์ที่ใหญ่เป็นอันดับแปดของโลก

เป็นที่น่าสังเกตว่าในตอนแรกแอมเจนทำงานร่วมกับ Goldwasser เพื่อจัดหาโปรตีน EPO ของมนุษย์ที่บริสุทธิ์สำหรับการจัดลำดับ แต่ในไม่ช้า Goldwasser และ Amgen ก็ล้มเหลวเนื่องจากความแตกต่างทางอุดมการณ์ Goldwasser และมหาวิทยาลัยชิคาโกของเขาซึ่งทำการวิจัยขั้นพื้นฐาน ไม่เคยคิดที่จะจดสิทธิบัตรฮอร์โมนที่เขาค้นพบ ดังนั้นจึงไม่ได้รับเงินสักบาทสำหรับความสำเร็จทางการค้าอย่างมหาศาลของ EPO

มันเป็นตัวกระตุ้นอย่างไร

เมื่อเราหายใจ ออกซิเจนจะเข้าสู่ไมโตคอนเดรียของเซลล์เพื่อขับเคลื่อนระบบทางเดินหายใจและผลิต ATP จำนวนมหาศาล ซึ่งเป็นแหล่งพลังงานหลักในร่างกายของเรา คนที่เป็นโรคโลหิตจางมีเซลล์เม็ดเลือดแดงที่แข็งแรงไม่เพียงพอ และผลที่ตามมาทันทีที่สุดคือพวกเขาไม่ได้รับออกซิเจนเพียงพอ ซึ่งทำให้พวกเขารู้สึกเหนื่อย คล้ายกับปัญหาการหายใจในระยะยาว เมื่อฉีด EPO ของมนุษย์เข้าไปใหม่ ร่างกายของผู้ป่วยโรคโลหิตจางจะผลิตเซลล์เม็ดเลือดแดงมากขึ้นนำพาออกซิเจนได้มากขึ้น และผลิต ATP โมเลกุลพลังงานได้มากขึ้น ช่วยบรรเทาอาการได้อย่างมีประสิทธิภาพ

อย่างไรก็ตาม บุคลากรทางการกีฬาบางคนเริ่มคิดถึง EPO ของมนุษย์แบบรีคอมบิแนนต์ หากใช้ฮอร์โมน recombinant เทียมประเภท EPO เพื่อกระตุ้นร่างกายของนักกีฬาให้ผลิตเซลล์เม็ดเลือดแดงมากขึ้น มีความเป็นไปได้ที่จะปรับปรุงความสามารถของนักกีฬาในการรับออกซิเจนและผลิตโมเลกุลพลังงาน ซึ่งยังสามารถปรับปรุงประสิทธิภาพของนักกีฬาในด้านความอดทน กิจกรรมต่างๆ เช่น ปั่นจักรยาน วิ่งทางไกล และสกีวิบาก เอกสารในปี 1980 ใน Journal of Applied Physiology แสดงให้เห็นว่าสารกระตุ้นเลือด (erythropoietin, ตัวพาออกซิเจนเทียมและการถ่ายเลือด) สามารถเพิ่มความทนทานได้ถึง 34 เปอร์เซ็นต์ หากนักกีฬาใช้ EPO พวกเขาสามารถวิ่งบนลู่วิ่งได้ 8 กิโลเมตรในเวลาน้อยกว่าเดิม 44 วินาที อันที่จริง การปั่นจักรยานและการวิ่งมาราธอนเป็นตัวการที่เลวร้ายที่สุดสำหรับสารกระตุ้น EPO ระหว่างการแข่งขัน Tour de France ปี 1998 แพทย์ประจำทีม Festina ชาวสเปนถูกจับที่ชายแดนฝรั่งเศสพร้อม EPO รีคอมบิแนนท์เทียม 400 ขวด! แน่นอนว่าผลลัพธ์คือทั้งทีมถูกไล่ออกจากทัวร์และถูกแบน

คณะกรรมการโอลิมปิกสากลได้เพิ่ม EPO เข้าไปในรายการต้องห้ามที่บาร์เซโลนาเกมส์ปี 1992 แต่การจัดระบบการทดสอบ EPO ของมนุษย์ใหม่นั้นทำได้ยากมาก จนก่อนเกมปี 2000 ไม่มีทางที่จะตรวจสอบได้อย่างมีประสิทธิภาพว่านักกีฬากำลังใช้มันอยู่หรือไม่ มีสาเหตุหลายประการ: 1) ปริมาณ EPO ในของเหลวในร่างกายต่ำมาก และ EPO ต่อมิลลิลิตรของเลือดในคนปกติจะอยู่ที่ประมาณ 130-230 นาโนกรัม; 2) องค์ประกอบกรดอะมิโนของ EPO รีคอมบิแนนท์เทียมนั้นเหมือนกับโปรตีน EPO ภายในร่างกายของมนุษย์ทุกประการ มีเพียงรูปแบบของไกลโคซิเลชันเท่านั้นที่แตกต่างกันเล็กน้อย 3) ครึ่งชีวิตของ EPO ในเลือดเพียง 5-6 ชั่วโมง และโดยทั่วไปจะไม่สามารถตรวจพบได้ภายใน 4-7 วันหลังการฉีดครั้งสุดท้าย 4) ระดับ EPO แต่ละรายการนั้นแตกต่างกันมาก ดังนั้นจึงเป็นการยากที่จะสร้างมาตรฐานเชิงปริมาณที่แน่นอน

ตั้งแต่ปี พ.ศ. 2543 WADA ได้ใช้การตรวจปัสสาวะเป็นวิธีการตรวจสอบทางวิทยาศาสตร์เพียงวิธีเดียวในการตรวจหา EPO ชนิดรีคอมบิแนนท์โดยตรง เนื่องจากความแตกต่างเล็กน้อยระหว่างรูปแบบไกลโคอิเลตของ EPO รีคอมบิแนนต์เทียมกับ EPO ของมนุษย์ คุณสมบัติที่มีประจุไฟฟ้าของโมเลกุลทั้งสองมีขนาดเล็กมากและสามารถแยกความแตกต่างได้ด้วยวิธีการอิเล็กโทรโฟรีซิสที่เรียกว่าการโฟกัสแบบไอโซอิเล็กทริก ซึ่งเป็นกลยุทธ์หลักสำหรับ การตรวจจับโดยตรงของ EPO รีคอมบิแนนท์เทียม อย่างไรก็ตาม EPO แบบรีคอมบิแนนท์บางส่วนที่แสดงออกโดยเซลล์ที่ได้มาจากมนุษย์ไม่แสดงความแตกต่างในไกลโคซิเลชั่น ดังนั้นผู้เชี่ยวชาญบางคนแนะนำว่า EPO จากภายนอกและ EPO จากภายนอกควรแยกความแตกต่างจากปริมาณไอโซโทปของคาร์บอนที่แตกต่างกัน

ในความเป็นจริง ยังมีข้อจำกัดในวิธีการทดสอบที่แตกต่างกันสำหรับ EPO ตัวอย่างเช่น แลนซ์ อาร์มสตรอง ตำนานนักปั่นชาวอเมริกัน ยอมรับว่าใช้ EPO และสารกระตุ้นอื่นๆ ในระหว่างชัยชนะ 7 รายการในตูร์ เดอ ฟรองซ์ แต่จริงๆ แล้วเขาไม่ได้รับการยืนยันว่ามีผลบวกต่อ EPO ในการทดสอบสารกระตุ้นใดๆ ในเวลานั้น เรายังต้องรอดูกันต่อไปว่าจะ "สูงขึ้นหนึ่งฟุต" หรือ "สูงขึ้นหนึ่งฟุต"

มันสร้างรางวัลโนเบลได้อย่างไร

คำพูดสุดท้ายเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่าง EPO กับรางวัลโนเบลสาขาสรีรวิทยาหรือการแพทย์ประจำปี 2562

EPO เป็นกรณีทั่วไปของการรับรู้และการตอบสนองต่อภาวะขาดออกซิเจนของร่างกายมนุษย์ ดังนั้น Semenza และ Ratcliffe สองผู้ได้รับรางวัลโนเบลจึงเลือก EPO เป็นจุดเริ่มต้นในการศึกษากลไกการรับรู้ของเซลล์และการปรับตัวต่อภาวะขาดออกซิเจน ขั้นตอนแรกคือการค้นหาองค์ประกอบของยีน EPO ที่สามารถตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงของออกซิเจน Semenza ระบุลำดับคีย์ 256 เบสที่ไม่มีการเข้ารหัสที่ส่วนปลายดาวน์สตรีม 3 'ของการเข้ารหัสยีน EPO ซึ่งตั้งชื่อองค์ประกอบการตอบสนองการขาดออกซิเจน หากลำดับองค์ประกอบนี้กลายพันธุ์หรือถูกลบออก ความสามารถของโปรตีน EPO ในการตอบสนองต่อภาวะขาดออกซิเจนจะลดลงอย่างมาก หากลำดับองค์ประกอบนี้ถูกหลอมรวมเข้ากับส่วนท้าย 3 'ของยีนอื่นที่ไม่เกี่ยวข้องกับการขาดออกซิเจน ยีนที่ถูกดัดแปลงเหล่านี้ยังแสดงการกระตุ้นแบบ EPOภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน

จากนั้น Ratcliffe และทีมของเขาได้ค้นพบว่าองค์ประกอบในการตอบสนองภาวะขาดออกซิเจนนี้ไม่ได้มีอยู่เฉพาะในเซลล์ไตหรือตับที่มีหน้าที่ในการผลิต EPO เท่านั้น แต่ยังอยู่ในเซลล์ประเภทอื่นๆ อีกมากมายที่สามารถทำงานได้ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน กล่าวอีกนัยหนึ่ง การตอบสนองต่อภาวะขาดออกซิเจนนี้อาจไม่เฉพาะเจาะจงกับ EPO แต่เป็นปรากฏการณ์ที่แพร่หลายมากขึ้นในเซลล์ เซลล์อื่นๆ เหล่านี้ซึ่งไม่มีหน้าที่ในการผลิต EPO ต้องมีโมเลกุล (เช่น ปัจจัยการถอดความที่รับผิดชอบในการเปิดการแสดงออกของยีน) ที่รับรู้การเปลี่ยนแปลงของความเข้มข้นของออกซิเจนและจับกับองค์ประกอบการตอบสนองที่ขาดออกซิเจนเพื่อเปิดใช้งานยีน เช่น EPO