2019 年诺贝尔生理学或医学奖的三位获得者 William G. Kaelin, Jr.、Gregg L. Semenza 和 Sir Peter J. Ratcliffe 已经因其在细胞如何感知和适应方面的工作而获得 2016 年拉斯克基础医学奖缺氧，所以这并不特别令人惊讶。他们发现并鉴定了关键分子缺氧诱导因子 1 (HIF-1)。今天我们要回到研究的原点，即促红细胞生成素，即EPO，一种神奇的分子。

它是红细胞生成中最重要的因素

红细胞是血液中含量最多的一类血细胞，是脊椎动物血液中输送氧气和二氧化碳的主要介质。红细胞在骨髓中产生：造血干细胞首先增殖分化为各种血细胞的祖细胞，红系祖细胞进一步分化成熟为红细胞。正常情况下，人体红细胞生成率很低，但在出血、溶血、缺氧等应激条件下，红细胞生成率最多可提高8倍。在这个过程中，促红细胞生成素EPO是最重要的因素之一。

EPO 是一种主要在肾脏合成的激素。它的化学性质是一种高度糖基化的蛋白质。为什么在肾脏？每分钟大约有一升血液流过肾脏，因此它们可以快速有效地检测血液中氧气含量的变化。当血液中的氧气含量低时，肾脏会迅速做出反应并产生大量的 EPO。后者通过血流循环到骨髓，在那里它促进红系祖细胞转化为红细胞。成熟的红细胞从骨髓中释放到循环系统中，以提高身体与氧气结合的能力。当肾脏感觉到血液中的氧气增加时，它们会减少 EPO 的产生，从而减少骨髓中红细胞的数量。

这是一个完美的调整环。但是，生活在高海拔地区的人和一些贫血患者经常会遇到血氧持续偏低的情况，无法完成上述循环，刺激肾脏不断分泌EPO，使血液中EPO浓度高于常人。

花了将近80年才被发现

与许多重大发现一样，科学家们对 EPO 的理解并非一帆风顺，一路上充满了疑问和挑战。从EPO的概念到最终确定具体分子，历时近80年。

1906年，法国科学家Carnot和Deflandre将贫血兔的血清注射到正常兔体内，发现正常兔血浆中红细胞计数升高。他们认为血浆中的一些体液因子可以刺激和调节红细胞的产生。这是第一个 EPO 概念原型。不幸的是，结果在随后的几十年里没有被复制，主要是因为新红细胞的计数不准确。

Reissmann 和 Ruhenstroth-Bauer 在 1950 年的联生实验提供了非常有力的证据。他们通过手术将两只活老鼠的循环系统连接起来，将一只置于缺氧环境中，另一只呼吸正常空气。结果，两只老鼠都产生了大量的红细胞。毫无疑问，血液中有一种激素可以刺激红细胞的产生，EPO 也由此得名。另一方面，EPO对缺氧非常敏感。

EPO是什么分子？美国科学家戈德瓦瑟历时30年，终于从生化层面弄清了这个问题。工欲善其事，必先利其器。 EPO的作用是刺激新的红细胞，但后者的计数不准确。红细胞中最重要的功能分子是含血红素的血红蛋白，它的中心含有一个亚铁离子。因此，Goldwasser 的团队用放射性铁同位素标记新生红细胞，并开​​发了一种检测 EPO 活性的灵敏方法。这使得从动物体液样品中分离和纯化极低浓度的 EPO（纳克/毫升）成为可能。但EPO的分离极其困难。他们从肾脏换成贫血的绵羊血浆，再换成钩虫感染导致严重缺铁的患者的尿液，最后在 1977 年从日本再生障碍性贫血患者的 2,550 升尿液中纯化出 8 毫克人类 EPO 蛋白。

1985年，完成了人EPO的蛋白质测序和基因克隆。 EPO基因编码193个氨基酸残基的多肽，在分泌过程中信号肽被剪断后成为由166个氨基酸残基组成的成熟蛋白，含有4个糖基化修饰位点。 1998年分析了EPO的NMR溶液结构和EPO及其受体复合物的晶体结构。至此，人们对EPO有了最直观的认识。

迄今为止，贫血的治疗通常需要输血来补充红细胞的不足。随着人们对 EPO 的了解越来越多，将其注射到自己的骨髓中以刺激红细胞生成使问题变得更加容易。但像 Goldwasser 所做的那样，直接从体液中纯化 EPO 很困难，而且收率很低。 EPO蛋白和基因序列的确定，使大量生产重组人EPO成为可能。

它是由一家名为 Applied Molecular Genetics (Amgen) 的生物技术公司完成的。 Amgen 成立于 1980 年，当时只有七名成员，希望利用当时新兴的分子生物学技术制造生物制药。干扰素、生长激素释放因子、乙型肝炎疫苗、表皮生长因子是他们目标清单上的热门名字，但这些尝试都没有成功。直到1985年，来自中国台湾的华人科学家林福坤克隆了人类EPO的基因，然后利用DNA重组技术实现了合成EPO的生产。

重组人EPO与内源性EPO蛋白具有相同的序列，也有相似的糖基化修饰。自然地，重组人EPO也具有内源性EPO的活性。 1989年6月，安进公司的第一个产品重组人促红细胞生成素Epogen被美国FDA批准用于治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗HIV感染引起的贫血。 Epogen 的销售额在短短三个月内就突破了 1600 万美元。在接下来的二十年里，安进公司主导了重组人 EPO 市场。 Epogen 仅在 2010 年就为安进公司带来了 25 亿美元的收入。 2018年，安进的股票市值为1288亿美元，成为全球第八大制药公司。

值得注意的是，安进最初与Goldwasser合作，提供纯化的人EPO蛋白用于测序，但很快Goldwasser和安进就因为意识形态的分歧闹翻了。 Goldwasser 和他的芝加哥大学从事基础研究，从未想过为他发现的激素申请专利，因此没有从 EPO 的巨大商业成功中得到一分钱。

它——它怎么会是一种兴奋剂

当我们呼吸时，氧气进入细胞的线粒体以驱动呼吸链并产生大量的 ATP，这是我们身体的主要能量来源。贫血的人没有足够的健康红血球，最直接的影响就是没有摄入足够的氧气，使人感到疲倦，类似于长跑时的呼吸问题。当注射重组人EPO时，贫血患者体内会产生更多的红细胞，携带更多的氧气，产生更多的能量分子ATP，有效缓解症状。

不过，一些体育工作者也开始想到重组人EPO。如果利用EPO型人工重组激素，刺激运动员身体产生更多的红细胞，就有可能提高运动员获得氧气和产生能量分子的能力，也可以提高运动员的耐力表现骑自行车、长跑和越野滑雪等项目。 《应用生理学杂志》1980 年的一篇论文表明，血液兴奋剂（促红细胞生成素、人工氧载体和输血）可以将耐力提高 34%。如果运动员使用 EPO，他们可以在跑步机上跑 8 公里，时间比以前少 44 秒。事实上，骑自行车和马拉松是促红细胞生成素兴奋剂最严重的罪魁祸首。 1998年环法自行车赛期间，Festina队的一名西班牙队医在法国边境携带400瓶人工重组EPO被捕！结果当然是整支球队都被踢出巡回赛并被禁赛。

国际奥委会在 1992 年巴塞罗那奥运会上将 EPO 列入禁用名单，但重新组织人体 EPO 测试非常困难，以至于在 2000 年奥运会之前没有办法有效检测运动员是否使用它。有几个原因：1）体液中EPO含量很低，正常人每毫升血液中EPO约为130-230毫微克； 2) 人工重组EPO的氨基酸组成与人内源性EPO蛋白完全相同，仅糖基化形式略有不同； 3）EPO在血液中的半衰期只有5-6小时，一般在末次注射后4-7天检测不到； 4）个体EPO水平差异很大，难以建立绝对的量化标准。

2000年起，WADA将尿液检测作为直接检测重组EPO的唯一科学验证方法。由于人工重组 EPO 的糖基化形式与人 EPO 的糖基化形式存在细微差异，两种分子的带电特性非常小，可以通过称为等电聚焦的电泳方法区分，这是主要策略直接检测人工重组EPO。但部分人源细胞表达的重组EPO在糖基化上无差异，因此有专家建议应通过碳同位素含量的不同来区分外源性EPO和内源性EPO。

事实上，EPO的不同检测方法仍然存在局限性。例如，美国自行车传奇兰斯·阿姆斯特朗承认在他的七次环法自行车赛胜利期间服用了 EPO 和其他兴奋剂，但当时在任何兴奋剂检查中都没有实际证实 EPO 呈阳性。是“高一尺”还是“高一尺”，我们还需拭目以待。

它是如何获得诺贝尔奖的

最后说一下 EPO 与 2019 年诺贝尔生理学或医学奖之间的联系。

EPO是人体对缺氧的感知和反应最典型的例子。因此，两位诺贝尔奖获得者Semenza和Ratcliffe选择EPO作为研究细胞感知和适应缺氧机制的起点。第一步是找到能够响应氧气变化的 EPO 基因元素。 Semenza 在编码 EPO 的基因的 3' 下游识别出一个关键的 256 碱基非编码序列，命名为缺氧反应元件。如果这个元件序列发生突变或缺失，EPO蛋白对缺氧的反应能力就会大大降低。如果该元件序列与其他与缺氧无关的基因的下游 3' 端融合，这些修饰基因也表现出 EPO 样激活在缺氧条件下。

Ratcliffe 和他的团队随后发现，这种缺氧反应元件不仅存在于负责产生 EPO 的肾脏或肝脏细胞中，而且还存在于许多其他可以在缺氧条件下发挥作用的细胞类型中。换句话说，这种对缺氧的反应可能不是 EPO 特有的，而是细胞中更普遍的现象。这些不负责产生 EPO 的其他细胞必须包含分子（例如负责开启基因表达的转录因子），这些分子可以感知氧气浓度的变化并与缺氧反应元件结合以开启 EPO 等基因。